بررسی ایمونوهیستولوژیک بیانHER2 و P53 در مننژیوم و ارتباط آنها با درجه هیستولوژیک

مقدمه

مننژیوم، تومور اولیه خوشخیم شایع اینتراکرانیال (15% الی30%) از منشا سلول‎های آراکنوئیدال می‎باشد و عموما در بالغین میانسال و بیشتر در زنان بروز می‎کنند که در اکثر موارد در صورت انجام عمل جراحی و رزکسیون کامل تومور درمان قطعی میسر خواهد بود(1-3). اما ماهیت همه انواع آن یکسان نبوده و در مواردی عود زودرس و متاستاز دوردست و گسترش از طریق مایع مغزی نخاعی مشاهده می‎شود. متاسفانه روش قطعی برای پیشبینی عوارضی از این دست وجود ندارد. مننژیوم‎ها بر اساس دسته‎بندی سازمان جهانی بهداشت سال 2007 و براساس نمای آناپلازی هیستولوژیک و یا رفتار تهاجمی بعضی از واریانت‎های هیستولوژیک به سه دسته تقسیم می‎شوند که عبارتند از خوشخیم (درجه 1)،آتیپیک (درجه 2) و آناپلاستیک (درجه3)(شکل 1).

این دسته بندی را در جدول شماره 1 مشاهده می‎کنید. درجات بالاتر هیستولوژیک بطور کلی با احتمال عود و مرگ و میر بیشتر همراه هستند اما این ارتباط قطعی و صد درصد نبوده و مننژیوم خوشخیم متاستاز دهنده به خوبی شناخته شده است (4). مخصوصا در مرزهای تعداد میتوز شمارش شده که تعیین کننده اصلی گرید هیستولوژیک و تغییر روند پایش بیمار یا احتمالا درمان رادیولوژیک می‎باشد ، اهمیت یافتن مارکرهایی که قدرت پیشگویی بهتر رفتار مننژیوم را داشته باشند ملموس‎تر است.

HER2 یک پروتین ترانس ممبران با فعالیت تیروزین کینازی است که ارتباط بروز بیش از حد آن با بدخیمی های مختلفی از جمله کانسر پستان ،کولورکتال ، تخمدان و... و همچنین رفتار تهاجمی در این تومور ها به اثبات رسیده است. بررسی بیان HER2   در مننژیوم در تحقیقات انگشت شماری صورت گرفته و نتایج متناقض میباشد. جدای از بررسی بیان HER2 برای کمک به پیشبینی بهتر رفتار مننژیوم، می‎توان از این اطلاعات برای بررسی درمان‎های احتمالی در جهت تارگت تراپی بر علیه HER2  (آنتی بادی‎های منوکلونال انسانی-Herceptin) بهره برد (5-9).

مارکر ایمونوهیستوشیمی احتمالی دیگری که می‎تواند در پیشبینی رفتار مننژیوم کمک کننده باشد پروتئین P53 می‎باشد. ژن پروتئین P53  از دسته ژن‎های سرکوبگر تومور بوده و بر ارتباط آن با رفتار تهاجمی و پروگنوز بد در تومورهای مختلف تاکید شده است. هرچند که بیان P53 به‎عنوان یک فاکتور پروگنوستیک دیگر در برخی مطالعات ارتباط قطعی با درجه هیستولوژیک  مننژیوم داشته ولی در همه مطالعات مخصوصا در باره ارتباط آن با عود تومور اتفاق نظر وجود ندارد (10)،لذا این مارکر در کنار HER2 مورد بررسی قرار گرفت. 

روش کار

مطالعه حاضر یک مطالعه گذشته نگر است که در آن بیان HER2 و P53 در مننژیوم و ارتباط بیان این مارکرها با درجه مننژیوم بر اساس تقسیم بندی WHO 2007 بررسی شد.

نمونه‎گیری غیر احتمالی مبتنی بر هدف از طریق بررسی پرونده های بایگانی بخش آسیب شناسی بیمارستان قایم مشهد بین سال‎های 1380 تا 1394 صورت پذیرفت. 57 بیمار که بر اساس پاسخ آسیب شناسی  تشخیص پاتولوژیک مننژیوم داشته‎اند و تکمیل اطلاعات مورد نیاز در مطالعه از جمله عود تومور از طریق بررسی پرونده و تماس تلفنی میسر شد وارد مطالعه گردید و بلوک‎های پارافینی آن‎ها استخراج شد.

معیارهای ورود به مطالعه از این قرار بود:

تومورهایی که بلوک پارافینی آنها بافت کافی برای بررسی ایمونوهیستوشیمی داشته باشد.

بیمارانی که پرونده بایگانی آن‎ها کامل بوده (از جمله عود تومور) و اطلاعات لازم برای مطالعه را شامل باشد.

معیار های خروج از مطالعه به شرح زیر بود:

تومورهایی که بر اساس نمای هیستولوژیک، رادیولوژیک و خصوصیات بالینی، تشخیص مننژِیوم قطعی نباشد.

تومورهایی که به دلایل تکنیکی امکان رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمی بلوک های پارافینی آن‎ها امکان پذیر نباشد.

لام‎های بیماران از بایگانی بخش استخراج و دوباره مورد بررسی قرار گرفت. تشخیص و درجه هیستولوژیک و ساب تایپ هیستولوژیک گزارش شده دوباره توسط دو پاتولوژیست تایید شد.

بلاک‎های مناسب جهت انجام رنگ‎آمیزی ایمونوهیستوشیمی انتخاب شدند. رنگ آمیزی برای جستجوی پروتئین P53 و HER2  با استفاده از کیت‎های شرکت دانمارکی DAKO به ترتیب با شماره کد  A 0485 (lot num: 8940016)و M 7001 (lot num: 2490013) به روش زیر انجام گرفت.در این پژوهش از آنتی بادی‎های بدون نیاز به رقیق سازی استفاده شد.

ازبلوک پارافینی مربوطه برش‎های 3 میکرونی بر روی لام‎های اکتیو (شارژدار) تهیه شد. سپس لام‎ها به مدت یک ساعت در فور به حرارت 60 درجه سانتیگراد قرار داده شد و بعد آن مرحله دپارافینه و هیدراتاسیون انجام شد. در مرحله بعد لام‎ها در محلول آنتی ژن رتریوال قرار داده شد و به مدت 30 دقیقه در بن ماری جوش با حرارت 94 تا 98 درجه سانتی گراد قرار داده شد. پس از سرد شدن لام‎ها به مدت 15 دقیقه در آب مقطر و سپس در محلول بافر تریس شستشو داده شد. پس از آن در محیط سر بسته مرطوب محلول پراکسیداز روی لامها ریخته شد و پس از گذشت ده دقیقه لام‎ها به مدت 5 دقیقه با آب مقطر و سپس بافر تریس شستشو داده شد. آنتی بادی مورد نظر در محیط سربسته مرطوب به مدت 60 دقیقه روی لام‎ها قرار گرفت و سپس لام‎ها به مدت 5 دقیقه با آب مقطر و سپس با بافر تریس شستشو داده شد. آنتی بادی ثانویه(EnVision) به مدت 20 دقیقه روی لام‎ها در محیط سربسته مرطوب قرار گرفت و لام‎ها به مدت 5 دقیقه با آب مقطر و سپس تریس شستشو داده شد. محلول کروموژن به مدت ده دقیقه در محیط سربسته مرطوب روی لام‎ها قرار گرفته و سپس به مدت 5 دقیقه با آب مقطر شستشو داده شد. پس از آن لام‎ها به مدت 5 دقیقه در محلول هماتوکسیلین مایر و سپس 5 دقیقه با آب مقطر شستشو شد. در انتها لام‎ها را به منظور دهیدراتاسیون نمونه‎ها در درصدهای افزایش یابنده الکل به ترتیب 70% - 80% - 90% -99% قرار داده شد و پس از خشک شدن لامل چسبانده شد.

در هر سری رنگ آمیزی از آدنوکارسینوم پستان HER2 مثبت و آدنوکارسینوم روده P53 مثبت بعنوان شاهد مثبت و از یک برداشت با حذف مرحله افزودن آنتی بادی اختصاصی اولیه به عنوان کنترل منفی استفاده شد. همچنین در هنگام مشاهده لام‎ها از  سلول‎های طبیعی مننگوتلیال غیر تومورال به عنوان کنترل منفی داخلی بهره گرفته شد. طبقه بندی  HER2 بر اساس معیار های مشخص خوانش آن در کانسر پستان (جدول 2) انجام شد و همانند کانسر پستان نمره‎های 2+ و 3+ ، HER2 مثبت (شکل 2) و نمره های 0 و 1+ ،HER2 منفی در نظر گرفته شد چرا که رنگ پذیری ضعیف (SCORE 1+) اهمیت پروگنوستیک یا درمانی و همراهی با تغییرات ملکولی ندارد. رنگ پذیری P53 بر اساس حد آستانه رنگ آمیزی قوی هسته ای در بیشتر از 5% هسته ها، توسط دو پاتولوژیست مورد خوانش قرار گرفت.

نهایتا داده‎ها به دقت وارد نرم افزار آماری SPSS  (نسخه22) شد و با استفاده از آزمون‎های آماری مختلف تجزیه و تحلیل آماری داده‎ها انجام گرفت. P-Value کمتر از 05/0 معنادار در نظر گرفته شد.

نتایج

تعدادکل بیماران 57 مورد می‎باشد. 42 (74%) بیمار زن و 15 (26%) بیمار مرد میباشند. نسبت ابتلا زن به مرد 84/2 میباشد.کمترین و بیشترین سن مربوط به بیماران مذکر بوده (به ترتیب 18 و 83 ساله) و دامنه سنی بیماران 65 سال است. متوسط سنی بیماران 9/46 سال است.1 مورد (8/1 %) مننژیوم آناپلاستیک و 9 مورد (8/15 %) مننژیوم آتیپیک و 3مورد (3/5 %)مننژیوم خوشخیم دارای عود و 44 مورد (2/77 %) مننژیوم خوشخیم بدون عود در مطالعه ما وجود داشت.

 8 مورد (14%) HER2 را بیان کردند. 1 مورد (100%) در میان مننژیوم‎های آناپلاستیک و 2 مورد (22%) در میان مننژیوم‎های آتیپیک و 1مورد (33%) در میان مننژیومهای خوشخیم دارای عود و 4 مورد (9%) در میان مننژیوم های خوشخیم بدون عود HER2 را بیان کردند. این اختلاف از نظر آماری معنی دار نیست (جدول 3).

6مورد (5/10 %) پروتئین P53 را بیان کردند. 1 مورد (100%) در میان مننژیوم‎های آناپلاستیک و 1 مورد (11%) در میان مننژیوم‎های آتیپیک و 2 مورد (66%) در میان مننژیوم‎های خوش خیم دارای عود و 2 مورد (5/4%) در میان مننژیوم های خوش خیم بدون عود P53 را بیان کردند. این اختلاف از نظر آماری معنی دار نیست (جدول 4).

همچنین از میان 8 مورد توموری که HER2 را بیان کرده اند 4 مورد بیان P53 نیز داشته اند. اما از میان 49 موردی که بیان HER2 نداشته‎اند تنها 2 مورد بیان P53 داشتند ، این تفاوت از نظر آماری با انجام تست دقیق فیشر معنادار می‎باشد (002/0=p) (جدول 5).

بین بیان HER2 و P53 و سایر پارامترهای جنس و سن و موقعیت مکانی تومور و نوع هیستولوژیک ارتباط معنا دار یافت نشد.

بحث

در مطالعه حاضر 14% موارد بیان HER2 و 5/10 % موارد بیان P53 داشتند. بیان  این دو مارکر مولکولی به نسبت بیشتری در تومورهای آناپلاستیک ، آتیپیک و خوشخیم دارای عود نسبت به خوشخیم بدون عود دیده میشود، بطوری که اگر تومورها را در دو دسته تقسیم نماییم، یک گروه شامل مننژیومهای خوشخیم دارای عود و آتیپیک وآناپلاستیک و دسته دیگر مننژیوم‎های خوشخیم بدون عود، در مجموع 13 مورد (8/22 %) در گروه اول و 44 مورد (2/77 %) در گروه دوم قرار میگیرند و 4 مورد (30%) از 13مورد گروه اول بیان HER2 وp53  و 4 مورد (9%) از 44 موردگروه دوم بیان HER2 و 2مورد (5/4 %) بیان p53 را نشان می‎دهند، که از نظر آماری معنادار خواهد بود(بیان HER2 با آزمون کای دو048/0=p و بیان P53 با آزمون دقیق فیشر02/0=p. اما ارتباط آماری معنادار بین بیان HER2 یا P53 و گرید هیستولوژیک یا عود تومور به صورت مجزا اثبات نشد (جداول 1-2).

مطالعات انگشت شماری به بررسی بیان HER2 در تومورهای مختلف سیستم عصبی پرداخته‎اند. بیان HER2 با پروگنوز بدتر در آستروسیتوم (11-15) ومدولوبلاستوم (16-18)  ارتباط دارد همچنین گلیوبلاستوم اولیه در مقایسه با انواع ثانویه به میزان بیشتری HER2 را بیان می‎کند(19).

از نظر ارتباط بین بیان HER2 و درجه هیستولوژیک مننژیوم که در مطالعات معدودی بررسی شده، کم و بیش پاسخ‎های حد وسط و متفاوت گزارش شده است. در مطالعه محزونی در دانشگاه اصفهان بروز HER2 در تومورهای درجه 2 و 3 حدود 38% میباشد که از بیان آن در تومورهای درجه 1 بیشتر است اما این اختلاف آماری معنی دار نمی‎باشد (20). همچنین لوسوآرن نتوانست رابطه معنا دار بین بیان HER2 و درجه هیستولوژیک مننژیوما بدست آورد هرچند بر ارتباط بین عود و بیان HER2 تاکید می‎کند(21). از طرفی وانگ و می در مطالعه خود بر روی 80 مورد مننژیوم به موارد زیر دست می آید که تا حدودی مشابه مقادیر بدست آمده در مطالعه ماست.

درصد بیان HER2 در مطالعه وانگ و می:

3 مورد از 20 مورد مننژیوم خوشخیم بدون عود (15%)

6 مورد از 20 مورد مننژیوم خوشخیم همرا با عود (30%)

7 مورد از 20 مورد مننژیوم آتیپیک (35%)

10 مورد از20 مورد مننژیوم بدخیم (50%)

   همچنین او مانند ما تومورهای خوشخیم عود کننده را از تومورهای خوشخیم غیر عود کننده جدا کرده است و ارتباط معنا داری از نظر آماری بین افرایش بیان HER2 و درجه هیستولوژیک و عود نشان داده است (22). واگ در مقاله خود نتایج تحقیقات مختلف در این زمینه را مرور کرده و به تفاوت های فوق برخورد می‎کند (23). عدم استفاده از آنتی بادی‎های یکسان و تفاوت در روندهای انجام ایمونوهیستوشیمی می‎تواند یکی از علل این نا همخوانی آماری در مطالعات مختلف از نظر شیوع بیان HER2 باشد. به هر روی وانگ و توو در مطالعه خارج از بدن بر روی سلول‎های تومورال مننژیوم نشان دادند که در گروه با بیان افزایش یافته HER2 تهاجم، مهاجرت و تکثیر سلول‎ها افزایش دارد و در صورتی که HER2 با واسطه interfering RNA مهار شود تکثیر سلولی کاهش یافته و آپوپتوز زودهنگام اتفاق می‎افتد.

ما، بین بیان افزایش یافته P53 و هیستولوژی یا رفتار نامطلوب (عود) تومور رابطه معنادار نیافتیم(05/0<‌p)، اما درصد بیان P53 در تومورهای دارای هیستولوژی یا رفتار نامطلوب (آتیپیک، آناپلاستیک ویا خوشخیم دارای عود) به طور متوسط 30% و بیشتر از مننژیوم‎های خوشخیم بدون عود(5/4 %) است. در مطالعات مختلف در سراسر دنیا  بر سر این موضوع نیز اتفاق نظر کامل وجود ندارد، در داخل کشور علیپور در مطالعه خود در دانشگاه علوم پزشکی مشهد بین درجه هیستولوژیک مننژیوم و بیان P53 رابطه معنادار بدست آورده است در مطالعه وی 100% موارد مننژیوم آتیپیک یا آناپلاستیک P53 را بروز دادند در صورتی که این نسبت در مننژیوم های خوشخیم تنها 06/0% بود. لکن مطالعه دیگری که در بیمارستان شهدای تجریش انجام گرفته، نتوانست ارتباط معناداری بین بیان P53 و درجه هیستولوژیک مننژیوم به دست آورد (087/0=p).

از سه مورد مننژیوم خوشخیم دارای عود در مطالعه حاضر 2 مورد بیان P53 داشتند. در مطالعه علیپور تومورهای عود کننده تنها در نوبت دوم بیان P53 (100% موارد) داشتند و هیچ کدام در نوبت اول ، بیان افزایش یافته­ای از نظر P53 نشان نداند لذا نتیجه می‎گیرد که بررسی P53 از نظر پیشبینی عود بی حاصل است. در مطالعلات خارجی، لامفازامز  در بررسی آینده نگر 69 مورد مننژیوم ، اظهار می‎کند که هیچ ارتباط بارزی از نظر میزان عود و بیان P53 وجود ندارد (26). از طرفی کامی در مطالعه 80 مورد مننژیوم  بر ارتباط بین بیان P53 و گرید هیستولوژیک و عود مننژیوم صحه می‎گذارد (27).

در مطالعه ما بین بیان HER2 و P53 ارتباط معنادار وجود دارد(05/0 > p) ، ما تنها یک مطالعه را یافتیم که به بیان در دو مارکر بطور همزمان در مننژیوم پرداخته باشد، عبدالظاهر که روی 60 مورد مننژیوم خوشخیم عود کننده تحقیق می‎کرد بین بیان HER2 و P53 رابطه معنادار پیدا نکرد (24). به هر حال در سایر منابع بر وجود رابطه بین بیان HER2 و P53 در سایر تومورها اشاره شده و به عنوان مثال اکرمن بر شیوع بیشتر بیان P53 در ساب تایپ ملکولی HER2 مثبت در کانسر پستان تاکید می‎کند (25).

در مطالعه حاضر بین بیان HER2 و P53 و سایر پارامترهای جنس و سن و موقعیت مکانی تومور و نوع هیستولوژیک ارتباط معنا دار یافت نشد.

نکات قوت مطالعه حاضر استفاده از روش رنگ آمیزی یکسان بر روی تمام نمونه‎ها و بررسی همزمان دو مارکر HER2 و P53 و در نظر گرفتن همزمان ویژگی‎های هیستولوژیک و رفتاری مننژیوم می‎باشد. ویژگی محدود کننده این مطالعه عدم تساوی تعداد موارد در گروه‎های با هیستولوژی و رفتار مطلوب و نامطلوب و حجم کم نمونه می‎باشد.

نتیجه گیری

در مننژیوم‎هایی که درجه هیستولوژیک تومور، مورد شک است خصوصا در مواردی که تعداد میتوز در حد مرزی می‎باشد رنگ آمیزی P53 , HER2  ممکن است بتواند در افتراق موارد بینابینی مورد استفاده قرار بگیرد. بررسی از نظر بروز HER2 و P53 شاید در برخی بیماران پلان درمانی را تغییر دهد و لزوم رادیوتراپی پس از جراحی را خاطر نشان سازد. بین بیان HER2 و P53 در مننژیوم احتمالا رابطه معنا دار برقرار است.

نهایتا نیکوست که در آینده مطالعاتی با در نظر گرفتن نکات زیر توسط محققان به انجام رسد.

مطالعاتی در زمینه استاندارد کردن روند انجام رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمی در تومورهای سیستم عصبی و تعیین میزان تاثیر رنگ آمیزی با آنتی بادی‎های مختلف در نتایج متناقض مطالعات گذشته.

مطالعاتی با جمعیت آماری بیشتر جهت رد یا اثبات رابطه بیان HER2 با هیستولوژی و رفتار مننژیوم.

همراه سازی مطالعات ایمونوهیستوشیمی HER2 با بررسی های ژنتیکی و مولکولی مرتبط با آن.

مطالعات آینده نگر از نظر بررسی ارتباط بیان اولیه HER2 و P53  با میزان عود و بیان این عوامل در مننژیوم عود کرده.

مطالعات RCT از نظر میزان تاثیر درمان با هرسپتین بر پیش آگهی مننژیوم دارای بیان HER2.