بررسی سطح ADMA و CRP در بیماران دیابتی با و بدون آلبومینوری

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 استادیار غدد و متابولیسم ، دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی، تهران، ایران

2 استادیار نفرولوژی،دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی، تهران، ایران

چکیده

مقدمه
 با توجه به شیوع روز افزون دیابت تیپ دو در سراسر جهان و اینکه عامل اصلی ESRD بیماری دیابت می باشد؛ مشخص کردن پاتوژنز عوارض کلیوی در بیماران دیابتی به خصوص در مراحل اولیه جهت جلوگیری از پیشرفت بیماری از اهمیت بسزایی برخورداراست.  این مطالعه با هدف  مقایسه سطح ADMA   و CRP در بیماران دیابتی نوع دو با و بدون آلبومینوری انجام شد.
روش کار
 دراین مطالعه توصیفی مقطعی که در بیمارستان ولیعصر در سال 1392 انجام شد. 80 بیمار مبتلا به دیابت نوع دو در دو گروه دارای آلبومینوری و بدون آلبومینوری وارد مطالعه شدند.  سطوح ADMA و CRP در همه بیماران.و , FBS HbA1C  و کراتینین سرم اندازه گیری شد. اطلاعات با آزمون های تی، من ویتنی، پیرسون، اسمیر نوف کلوگروف و SPSS بررسی شد.
نتایج
در این مطالعه، سطح CRP در گروه آلبومینوری بیشتر از گروه بدون آلبومینوری بود اختلاف آنها به‌لحاظ آماری معنی‌داری بود.  و ارتباط سطح CRP و ADMA در 2 گروه براساس سطوح مختلف CRP (5/3<CRP، 5/3>CRP)  انجام شد.در گروه آلبومینوری سطح ADMA هم در  سطح پایین CRP (5/3>CRP ) و هم در سطح بالای CRP (5/3<CRP) بالا می‌باشد، ولی در گروه بدون آلبومینوری سطح ADMA در  سطح پایین CRP ,,پایین و در سطح بالای CRP , بالا می‌باشد؛ یعنی سطح ADMA به موازات بالا رفتن سطح CRP افزایش می‌یابد.
نتیجه گیری
 با توجه به  ارتباط مثبت  میان ADMA با CRP در گروه بدون آلبومینوری و افزایش سطح ADMA مطابق با شرایطHigh CRP در گروه بدون آلبومینوری می‌توان نتیجه گرفت که ارتباط بین مارکرهای التهابی  و دیس‌فانکشن اندوتلیال نقش مهم التهاب مزمن زمینه‌ای را در  پاتوژنز عوارض میکرو واسکولار کلیوی در شروع نفروپاتی مطرح می‌کند و  عدم تفاوت سطح ADMA در گروه آلبومینوری چه در سطح پایین یا بالای التهاب نشان می‌دهد که زمانی که آلبومینوری ایجاد می‌شود عوامل دیگری غیر از مسیر التهاب و CRP در پاتوژنز آن مشارکت دارد.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Evaluating AsymmetricDimethylarginine and C-Reactive Protein in Diabetic Patients with and without Albuminuria

نویسندگان [English]

  • Zahra Davoodi 1
  • Narges Zahed 2
1 asistant Professor of Endocrinology and Metabolism, Shahid Beheshti University of Medical Sciences, Tehran, Iran
2 asisant professor of Nephrology, Shahid Beheshti University of Medical Sciences, Tehran, Iran
چکیده [English]

Objectives: Many studies have shown that microalbuminuria is a strong and independent predictor of progressive kidney disease, cardiovascular events and all-cause mortality and morbidity in diabetic Patients, ADMA has been implicated as a possible modulator of inducible NOs during inflammation, In addition, it is reported that high serum levels of C-reactive protein (CRP) is a novel cardiovascular risk factor that impairs endothelial function. The aim of this study was to evaluate the relationship between ADMA, hs- CRP and albuminuria in Type 2 Diabetic Patients.
Methods:_This is a cross sectional study on 80 patients with type II diabetes who were normally distributed in two groups: those with albuminuria and those without albuminuria. For all patients, levels of ADMA ,CRPand serum levels of fasting blood sugar (FBS), HbA1C, and creatinine were measured.
Results:_hs-CRP was significantly higher in group with albuminuria than without albuminuria (p<0.05); age and sex-adjusted ADMA values were significantly (p<0.05) correlated with hs-CRP(r=./35) and GFR (r=./39)in normoalbuminuric group. We evaluated The relationship between ADMA and CRP levels in the two groups with and without albuminuria at different CRP levels (cut point:3.5mg/dl); In the albuminuric group, the ADMA level was high at both low CRP (CRP<3.5) and high CRP (CRP>3.5) conditions.  in the normoalbuminuric group , ADMA level was low at low CRP conditions but high at high CRP conditions ; in the other words, ADMA level increased parallel with the CRP level.
Conclusion:_positive correlation between hs-CRP and ADMA in normoalbuminuric group and the difference of ADMA levels between albuminuric and normoalbuminuric groups were only significant at low inflammatory state; suggested thatADMA could contribute to development of albuminuria possibly via independent hs- CRP.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Asymmetric Dimethylarginine
  • C-reactive protein
  • Type 2 diabetes
  • Albuminuria

مقدمه

در سالهای اخیر به دلیل تغییر شیوه زندگی و افزایش چاقی شیوع ابتلا به دیابت نوع دو تشدید یافته است (1). حدود 90% بیماران مبتلا به دیابت از نوع دو می باشند. از عوارض مهم بیماری دیابت نفروپاتی است که علت اصلی عوارض و مرگ و میر در بیماران دیابتی می باشد و تقریباً 5 - 40 % بیماران دیابت تیپ دو دچار نارسایی کلیه می شوند و 20 % در زمان تشخیص نارسایی کلیه دارند و 40 % در طی 10 سال دچار نارسایی کلیه و نفروپاتی می شوند، ضایعات کلیوی در دیابت نوع دو، هتروژن بوده و از پیچیدگی بیشتری نسبت به دیابت نوع یک برخوردارند (2).

 آلبومینوری مارکر زودرس نفروپاتی دیابتی است که با تغییرات ساختمانی عروق همراه است.   در بیماران دیابت نوع دو، افزایش ترشح آلبومین ادراری ریسک فاکتور بیماری قلبی عروقی نیز می­باشد (3).

1ADMA مهار کننده رقابتی محصول متابولیت ال ارژنین  در سنتز نیتریک اکسید است؛ اگرچه ADMA به وسیله کلیه ها دفع می شود ولی مسیر متابولیسم آن تخریب به وسیله دی متیل آمینوهیدرولاز2، دی متیل آرژنین3 (DDAHs)  1,2 به دی متیل4 و ال – سیترولین5  است; تولید استرس اکسیداتیو در اثر هیپرگلیسمی باعث اختلال فعالیت DDAHs در عضلات صاف عروق و اندوتلیوم می شود و باعث افزایش ADMA در بیماران دیابتی می شود (4).  

 نقش  ADMA در بیماران با اختلال عملکرد اندوتلیال شامل بیماری مزمن کلیوی، هیپرتانسیون اسنشیال، آترواسکلروزیس ساب کلینیکال و حوادث کرونری مطالعه شده است (5).  ADMA همچنین با عوارض میکروواسکولار دیابت مربوط است.  ADMA در بیماران دیابت نوع یک و دو با نفروپاتی دیابتی افزایش می یابد که نشانگر نارسایی کلیه در این بیماران می باشد (5-7). 

دیابت از جمله بیماریهای است که در آن سیستم ایمنی فعال     می گردد ؛ اکنون این تئوری تقویت شده است که یکی از عوامل اصلی ارتباط تنگاتنگ بیماریهای قلبی و عروقی و دیابت همین فعال سازی سیستم ایمنی و ایجاد التهاب است ؛  پروتئین واکنشگر C ( 6CRP ) که در شرایط التهاب حاد مثل بیماریهای عفونی و بیماریهای بافت همبند افزایش می یابد، در دیابتی های تیپ دو و دیابت طول کشیده تیپ یک نیز می توان افزایش این نشانگر التهابی را رد یابی نمود (8).

 این مطالعه با هدف بررسی سطح ADMA  در بیماران دیابتی نوع دو با و بدون آلبومینوری در سطوح مختلف CRP انجام شد.

 

روش کار

این مطالعه به روش توصیفی مقطعی در سال 1392 انجام شد. این مطالعه در بین80 بیمار مبتلا به دیابت نوع دو مراجعه کننده به درمانگاه غدد بیمارستان ولیعصر انجام شد. بدین ترتیب که کلیه افراد مراجعه کننده تا تکمیل حجم نمونه مورد نظر به شرط دارا بودن معیارهای پذیرش انتخاب شدند.  معیارهای خروج شامل بیماران با عدم رضایت برای شرکت در طرح، بدخیمی، التهاب و عفونت حاد، نارسایی قلبی پیشرفته، نارسایی کبد بود. و بیماران به دو گروه مورد ( آلبومینوری بیشتر از 30mg در 24 ساعت ) و کنترل طبیعی ( آلبومینوری کمتر از 30mg در 24 ساعت ) تقسیم شدند و اطلاعات دموگرافیک شامل سن وجنس و قد و وزن وBMI  وطول مدت دیابت وسابقه عوارض مزمن دیابت در فرمهای اطلاعاتی از پیش آماده شده ثبت شد.

 

جهت انجام آزمایشات  برای اثبات وجود یا عدم وجود آلبومینوری از تست ادرار 12 ساعته برای تشخیص به روش توربیدومتری استفاده شد سطح ADMA و CRP در همه بیماران مورد بررسی در وضعیت ناشتا ( نخوردن مواد غذایی به مدت 8 ساعت )  با استفاده از روش GC-MS الیزا(ELISA)[1] و کیت (ADMA-ELISA, DLD Diagnostika GmbH, Hamburg, Germany) اندازه گیری شد.

اطلاعات مورد نیاز طرح با استفاده از اطلاعات موجود در پرونده بیمار و اطلاعات حاصله از برگه های آزمایشگاهی به دست آمده در برگه های اطلاعاتی از پیش آماده شده ثبت شدند. کلیه اطلاعات کدگذاری شده توسط برنامه آماری  SPSS وارد حافظه رایانه گردیدند.

به جهت تجزیه و تحلیل اطلاعات، میانگین داده های کمی نظیر سن ، سطح ADMA و فراوانی داده کیفی نظیر جنس  محاسبه گردیدند. مقایسه متغیرهای کمی بین دو گروه با تست های تی، من ویتنی و مقایسه متغیرهای کیفی توسط کای – دو صورت پذیرفت، برای محاسبه­ی همبستگی از تست پیرسون استفاده شد جهت بررسی همبستگی میان ADMA با CRP و سایر متغیر های دیگر که بر اساس سن و جنس تعدیل شدهاند  ، در گروه­های با و بدون آلبومینوری از ضریب همبستگی نسبی2 و از مدل کنترل شده(multiple Adjusted models ) استفاده شد.  لازم به ذکر است پراکندگی نمونه ها توسط اسمیرنوف کل.گروف بررسی شد. 05/0> P از نظر آماری معنی دار در نظر گرفته شد.

 

نتایج

در این مطالعه 40  نفر دارای آلبومینوری (22 مرد و 18 زن)، 40 نفر  بدون آلبومینوری (11 مرد و 29 زن) شرکت داشتند. گروه­های مورد مطالعه از نظر سن، مدت ابتلاء به دیابت  ،  BMI،  و HbA1c  با هم سازگار  بودند. ( جدول 1).میانگین آلبومینوری در گروه دارای آلبومینوری 118 ±238 ودر گروه بدون آلبومینوری   8/11 ±6/12 بود. مقایسه اطلاعات آزمایشگاهی بین دو گروه مورد بررسی در جدول شماره 2 آمده است. غلظت سرمی ADMA در گروه بدون آلبومینوری 10/0±39/0 میکرومول بر لیتر و در گروه دارای آلبومینوری 14/0±43/0 میکرومول بر لیتر بود که با یکدیگر تفاوت معنی­داری نداشتند  (16/0p=). میزان CRP در گروه فاقد آلبومینوری 4/3±8/3 میلی گرم بر دسی لیتر و در گروه دارای آلبومینوری 5/4±7/5 میلی گرم بر دسی لیتر بود (05/0= P).

در مطالعه حاضر، ADMA  با کراتینین ارتباط مثبت معنی داری را در کل بیماران نشان داد  (001/0=p ، 358/0 = r). وADMA  با GFR ارتباط معکوس معنی داری را در کل بیماران نشان داد  (006/0=p ، 306/0- = r) ، که در نمودار شماره 1 نشان داده شده است. جهت بررسی رابطه­ی ADMA با CRP در گروه­های مورد بررسی، در زمان آنالیز داده­ها متوجه توزیع غیرنرمال ADMA  شدیم. با توجه به چولگی (Skwed) شکل، ریشه­ی دوم (ADMA sq) ADMA  استخراج شد، و در این حالت توزیع نرمال ADMA  به دست آمد و در تست­های پارامتریک بعدی مورد استفاده قرار گرفت. سپس بر اساس مدل خطی عمومی( general line model) و آنالیز تک متغیره( univariate anaslysis) ارتباط بین ADMA   به عنوان متغیر وابسته در سطوح مختلف CRP (5/3<CRP ، 5/3>CRP )، با گروه­های آلبومینوری و بدون  آلبومینوری بررسی شد.)نمودارشماره2).

 در گروه آلبومینوری سطح ADMA هم در سطح پایین CRP (5/3>CRP) و هم در سطح بالای CRP (5/3<CRP) بالا است، ولی در گروه بدون آلبومینوری سطح ADMA در سطح پایین CRP (5/3>CRP) ، پایین و در سطح بالای CRP (5/3<CRP) بالا است؛ یعنی سطح ADMA به موازات بالا رفتن سطح CRP افزایش می­یابد.

در سطوح پایین­تر CRP سطح ADMA پایین­تری در گروه بدون آلبومینوری وجود دارد و با تفاوتی که از ADMA  بالاتر در گروه آلبومینوری وجود دارد، در این حالت ارتباط ADMA با آلبومینوری معنی­دار می­شود.

 ولی در سطوح بالاتر CRP در گروه بدون آلبومینوری، سطح ADMA به موازات بالا رفتن سطح CRP افزایش می­یابد و مشابه سطح ADMA  در گروه آلبومینوری می­شود؛  در این حالت ارتباط ADMA با آلبومینوری معنی­دار نمی­شود.

 

بحث

آلبومینوری یکی از اولین تظاهرات بدون علامت صدمات میکرو­واسکولار در دیابت است که مشخصه شروع یا پیشرفت نفروپاتی دیابتی است و با افزایش ریسک قلبی عروقی مرتبط است (9). بنابراین اسکرینینگ برای تخمین آلبومینوری در همه بیماران دیابتی برای مشخص کردن بیماران در معرض خطر عوارض طولانی مدت توصیه می­شود.

در سالهای اخیر بیومارکر­های سرمی و ادراری متعددی برای تخمین شروع و پیشرفت آلبومینوری در بیماران دیابتی تیپ 2 برای جلوگیری از عوارض طولانی مدت کلیوی بررسی شده است.

در این مطالعه، سطح ADMA در گروه آلبومینوری بیشتر از گروه بدون آلبومینوری بود ولی اختلاف آنها به­لحاظ آماری معنی­داری نبود که  مطابق با مطالعات دیگر در این زمینه نمی باشد.( درمطالعاتی که در مصر توسط اسل1 و سایر همکاران در سال 2009  و هانای2 و سایر همکاران در ژاپن در سال 2008  انجام شد، ADMA ارتباط مثبتی با پیشرفت بیماری کلیوی و درجه پروتئینوری داشت و به این نتیجه رسیدند که ADMA می تواند به عنوان مارکر پیشرفت بیماری کلیوی در بیماران دیابتی به کار رود، این مطالعات به­صورت کوهورت و آینده نگر بوده­است و بر اساس پیشرفت ­آلبومینوری در طی فالوآپ چندساله سطح ADMA بالا رفته است و به­عنوان مارکر پیشرفت نفروپاتی تایید شده است (6، 10). ولی مطالعه حاضر به صورت مقطعی انجام شده است.:علاوه بر این بیماران برحسب درجات مختلف آلبومینوری (نورمو­آلبومینوری و میکرو­آلبومینوری و ماکرو­­آلبومینوری) بررسی شدند و گروه کنترل سالم هم داشتند؛ ولی در مطالعه حاضر طبقه­بندی آلبومینوری مشابه این مطالعه نبوده و گروه کنترل سالم هم نبود، پس نتایج سطح ADMA را می­توان به طبقه­بندی مختلف آلبومینوری در دو مطالعه هم ­ ربط داد.

 ADMA  با کراتینین ارتباط مثبت معنی­دار و با GFR ارتباط معکوس ضعیف  معنی­داری را در کل بیماران مورد بررسی نشان داد، یافته های به دست آمده در مطالعه حاضر توسط دیگر مطالعات تایید شده است (6، 7، 10).

در این مطالعه، سطح CRP در گروه آلبومینوری بیشتر از گروه بدون آلبومینوری بود واختلاف آنها به­لحاظ آماری معنی­داری بودو ارتباط سطح CRP و ADMA در دو گروه آلبومینوری و بدون آلبومینوری براساس سطوح مختلف CRP انجام شد.

در گروه آلبومینوری سطح ADMA هم در سطح پایین CRP (5/3>CRP) و هم در سطح بالای CRP (5/3<CRP) بالا می­باشد، ولی در گروه بدون آلبومینوری سطح ADMA در سطح پایین CRP (5/3>CRP) ، پایین و در سطح بالای CRP (5/3<CRP) بالا می­باشد؛ یعنی سطح ADMA به موازات بالا رفتن سطح CRP افزایش می­یابد.

همبستگی مثبت  میان ADMA با CRP در گروه بدون آلبومینوری و افزایش سطح ADMA در گروه بدون آلبومینوری در شرایط (High CRP) یا سطح بالای التهاب حاکی از آن است که التهاب اولیه در بیماران دیابتی در  افزایش سطح ADMA موثر است که مشابه آن در مطالعات داخل آزمایشگاهی نشان دادند که در شرایط التهاب سطح فعالیت DDAH (مسیر متابولیسم ADMA) کاهش می­یابد و منجر به افزایش ADMA می­شود (11).

مطالعات دیگری که ارتباط مثبت سطح CRP با آلبومینوری را نشان دادند، می­توان از تحقیقی که توسط زامبرانوگالوان3  در سال 2011  و جیانگ4 در سال 2012 نام برد، همچنین   آبحیجیت5 و همکاران هم باتوجه به گزارشات بدست آمده ازsurvey  NHANES  در سالهای 1999 تا 2004 ارتباط مثبت سطح بالای CRP با میکرو آلبومینوری  را مطرح کردند و التهاب عروقی را که با CRP قابل اندازه­گیری است در پاتوژنز اولیه بیماری مزمن کلیوی مطرح کردند (12-14).

هایپرگلیسمی در بیماری دیابت با تولید استرس اکسیداتیو باعث افزایش ADMA  و مهار نیتریک اکسید می­شود. علاوه براین با پیشرفت نفروپاتی دیابتی  سطح ADMA به موازات کاهش فانکشن کلیه بالا می­رود و افزایش آن باعث مهار بیشتر نیتریک اکسید و  منجر به اندوتلیال دیس­فانکشن و عوارض میکرو و ماکرو وسکولار دیابت می­شود (5).

 

نتیجه گیری

 با توجه به  ارتباط مثبت  میان ADMA با CRP در گروه بدون آلبومینوری و افزایش سطح ADMA مطابق با شرایط التهاب بالا (High CRP) در گروه بدون آلبومینوری می­توان نتیجه گرفت که ارتباط بین مارکرهای التهابی (CRP)  و دیس­فانکشن اندوتلیال (افزایش سطح ADMA ) نقش مهم التهاب مزمن زمینه­ای را در  پاتوژنز عوارض میکرو واسکولار عروق کلیوی در شروع نفروپاتی مطرح می­کند و  عدم تفاوت سطح ADMA در گروه آلبومینوری چه در سطح پایین یا بالای التهاب (CRP) نشان می­دهد که زمانی که آلبومینوری ایجاد می­شود عوامل دیگری غیر از مسیر التهاب و CRP در پاتوژنز آن مشارکت دارد.

پیشنهاد می­گردد این مطالعه با حجم نمونه بیشتر و با داشتن گروه کنترل و شناسایی مداخلات دارویی و تکرار آزمایشات انجام شده صورت پذیرد.



 

  1. Mensah GA, Mokdad AH, Ford E, Narayan KM, Giles WH, Vinicor F, et al. Obesity, metabolic syndrome, and type 2 diabetes: Emerging epidemics and their cardiovascular implications. Cardiol Clin 2004;22(4):485-504.
  2. Gambara V, Mecca G, Remuzzi G, Bertani T. Heterogeneous nature of renal lesions in type II diabetes. J Am Soc Nephrol 1993; 3(8):1458-1466.
  3.  Stehouwer CD, Gall MA, Twisk JW, Knudsen E, Emeis JJ, Parving HH. Increased urinary albumin excretion, endothelial dysfunction, and chronic low-grade inflammation in type 2 diabetes: progressive, interrelated, and independently associated with risk of death. Diabetes 2002;51(4): 1157-1165.
  4. Lin KY, Ito A, Asagami T, Tsao PS, Adimoolam S, Kimoto M, et al. Impaired nitric oxide synthase pathway in diabetes mellitus: role of asymmetric dimethylarginine and dimethylarginine dimethylaminohydrolase. Circulation. 2002;106(8):987-992.
  5.   Tarnow L, Hovind P, Teerlink T, Stehouwer CD, Parving HH. Elevated pasma asymmetric dimethylarginine as a marker of cardiovascular morbidity in early diabetic nephropathy in type 1 diabetes. Diabetes Care 2004; 27(3):765-769.
  6.   Hanai K, Babazono T, Nyumura I, Toya K, Tanaka N, Tanaka M, et al. Asymmetric dimethylarginine is closely associated with the development and progression of nephropathy in patients with type 2 diabetes. Nephrol Dial Transplant 2009;24(6):1884-1888.
  7. Krzyzanowska K, Mittermayer F, Shnawa N, Hofer M, Schnabler J, Etmüller Y, et al. Asymmetrical dimethylarginine is related to renal function, chronic inflammation and macroangiopathy in patients with type 2 diabetes and albuminuria. Diabet Med 2007;24(1):81-86.
  8.  Castoldi G, Galimberti S, Riva C, Papagna R, Querci F, Casati M,et al. Association between serum values of C-reactive protein and cytokine production in whole blood of patients with Type2 diabetes. Clin Sci (Lond) 2007;113(2):103-108.
  9.   Ninomiya T, Perkovic V, de Galan BE, Zoungas S, Pillai A, Jardine M, et al. (2009) Albuminuria and kidney function independently predict cardiovascular and renal outcomes in diabetes. J Am Soc Nephrol 2009;20(8):1813-1821.
  10. Assal HS, Younes K, Alsayed A, Hasan N, Ali AR. Asymmetric Dimethylarginine (ADMA) and Progression of Nephropathy in Patients with Type 2 Diabetes. Kidney 2009; 18:247-251.
  11.    Ueda S, Kato S, Matsuoka H, Kimoto M, Okuda S, Morimatsu M, et al. Regulation of cytokine-induced nitric oxide synthesis by asymmetric dimethylarginine: role of dimethylarginine dimethylaminohydrolase. Circ Res 2003; 92(2):226233.
  12.    Zambrano-Galvan G, Rodríguez-Morán M, Simental-Mendía LE, Lazalde B, Reyes-Romero MA, Guerrero-Romero F. C-reactive protein is directly associated with urinary albumin-to-creatinine ratio. Arch Med Res 2011 Aug;42(6):451-456.
  13. Jiang L, Huang W, Liang Y, Wang F, Duan X, Yang X, et al. Metabolic syndrome, C-reactive protein and microalbuminuria in a rural Chinese population: a cross-sectional study. BMC Nephrol 2013; 14:118. 
  14.  Kshirsagar AV, Bomback AS, Bang H, Gerber LM, Vupputuri S, Shoham DA, et al. Association of C-Reactive Protein and Microalbuminuria (from the National Health and Nutrition Examination Surveys, 1999 to 2004). Am J Cardiol 2008 February 1; 101(3): 401-406.
  15. Hiragushi K,Sugimoto H ,Shikata K, Yamashita T, Miyatake N, Shikata Y, et al. Nitric oxide system is involved in glomerular hyperfiltration in Japanese normoand micro-albuminuric patients with type 2 diabetes. Diabetes Res Clin Pract 2001;53(3):149-159.