شناسایی مولکولی فسفولیپاز B3 به عنوان عامل موثر در بیماری زایی آسپرژیلوس فومیگاتوس

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشیار مرکزتحقیقات بیوتکنولوژی، مرکز تحقیقات تغذیه، مرکزتحقیقات بیماری های عفونی و گرمسیری دانشگاه علوم پزشکی تبریز تبریز، ایران

2 استاد مولکولار بیولوژی - گروه PME - دانشکده علوم حیاتی - دانشگاه منچستر

3 استاد بیماری های عفونی و فوق تخصص میکوزهای ریوی- گروه PME- دانشکده علوم حیاتی - دانشگاه منچستر

4 دانشیار گروه انگل شناسی وقارچ شناسی دانشگاه علوم پزشکی اهواز، اهواز، ایران

5 دانشیار گروه انگل شناسی وقارچ شناسی دانشگاه علوم پزشکی یزد، یزد، ایران

چکیده

مقدمه
فسفولیپدها یکی از ترکیبات اصلی غشا سیتوپلاسمی سلول های یوکاریوتی می باشند. فسفولیپازها نیز آنزیم هایی هستند که در همه سلول های یوکاریوت وجود دارند و با توجه به وجود فسفولیپدها در غشا سیتوپلاسمی یوکاریوت ها روشن است که قدرت تخریب غشا سیتوپلاسمی به وسیله این آنزیم ها می تواند نقش مهمی در بیماری زایی میکروارگانیسم ها داشته باشد. با توجه به موضوعات فوق، در این تحقیق کلونینگ و تعیین توالی ژن فسفولیپاز B3 در آسپرژیلوس فومیگاتوس انجام پذیرفت.
روش کار
این مطالعه توصیفی در مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی دانشگاه علوم پزشکی تبریز در سال 1389-1387 انجام شده است. DNA ژنومی قارچ های آسپرژیلوس فومیگاتوس، آ. نیجر، کاندیدا آلبیکانس، اورئوبازیدیوم پولولنس و فوزاریومونوناتوماستخراج ومتعاقب تکثیرقطعه مورد نظربا PCR، محصو.ل PCR به حامل pGEMT-Easy vector پیوند زده شد و به سلول میزبان ('E.coli Top 10 F) ترانسفورم گردید.
نتایج
مقایسه همسانی توالی نوکئوتیدی نوکئوتیدی و اسید امینه ای سـکوانس نوکلئوتیـدی ژن plb3 بـه دسـت آمـده بـه طـول bp 2028، همسانی بسیار بالایی با توالی نوکلئوتیدهای نوکلئوتیدهای ژن های مشابه در سایر قارچ ها نشان می دهد.
نتیجه گیری
آنالیز درخت فیلوژنیک ژن plb3 نشان می دهد که این ژن با گروه بزرگی از ژن های مشابه در سایر میکروارگانیسم ها ارتباط دارد و مقایسه همسانی توالی این ژن با ژن مشابه در قارچ های دیگر، نشان دهنده همسانی زیاد توالی این ژن با ژن های PLB در سایر قارچ ها است. مطالعات مربوط به تعیین توالی ژن هایی که عملکرد آنها در بیماریزایی میکروارگانیسم ها موثر می باشند، عمدتا به منظور استنباط اطلاعات برای ارائه شیوة مصونیت بخشی، تهیه واکسن، طراحی دارو، تهیه بلوکر برای خود ژن و یا محصول ژن و استفاده از آن ها به عنوان معرف آزمایشگاهی وجود عفونت انحام می گیرد.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Molecular Detection of Phospholipase B3 as an Effective Factor in Virulence of Aspergillus Fumigatus

نویسندگان [English]

  • Abdolhasan Kazemi 1
  • Jefri Robson 2
  • Deivid Denning 3
  • Ali Zarei MahmoudAbadi 4
  • Abbasali Jafari 5
1 Associated Professor of Biotechnology, Infectious & tropical disease, Nutrition Research Center, Tabriz Uni. of Medical. Sciences, Tabriz, Iran
2 PME Dept., Faculty of Life Science, the Unversityi. Of Manchester, UK
3 PME Dept., Faculty of Life Science, the Unversityi. Of Manchester, UK
4 Associated Professor of Medical Mycology, School of Medicine, Ahvaz University. of Medical. Sciences, Ahvaz, Iran.
5 Associated Professor of Medical Mycology, School of Medicine, Yazd University. of Medical. Sciences, Yazd, Iran
چکیده [English]

Introduction
Phospholipases are the major component of all eukaryotic bilayer cell membranes. and serve as a scaffold for membranes proteins. Phospholipases are a class of ubiquitous enzymes that have estrase activity and due to their ability to lyses of cell membrane can play an important role for pathogenicity of microrganisims. During this study using degenerate primers based on homologous amino acid sequences of some fungi phospholipase B (PLB), detection of Aspergillus fumigatusPLB3 was carried out.
Materials and Methods
After DNA extraction of A. fumigatus, A. niger, Fusarium venonatum and Aurobasidiumpullulans PCR reaction was carried out using degenerate primers. Predicted 2100 bp product from A. fumigatus was cloned in pGEMT-Easy vector and then transformed into E. coli Top 10 F’ competent cell for extraction of cloned DNA fragment.
Result
Sequence analysis of 2100 bp fragments using BLASTX software were revealed a high homology to published PLB sequences from other fungi.
Conclusion
Phylogenic tree analysis of PLB3 gene shows that PLB and potential PLB analogues like lysophospholipase are contained in a large cluster of the PLB family. A. fumigatus PLB gene is more closely related to A. oryzae, A. niger, Penicillium chrysogenum and Neurospora crassa than other fungi. Also, sequence availability of full length PLB3 gene represents a noteworthy breakthrough in the study of this opportunistic pathogen and function of PLB3 gene in pathogenesis of A. fumigates. Detection of PLB3 gene can be lead to preparing vaccine, blocker and laboratory marker for recognition of PLB3 gene products either in patient body or clinical samples.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Aspergillus fumigates
  • Phospholipase B3
  • Virulence
1- Alp S, Arikan S. Investigation of extracellular elastase, acid proteinase and phospholipase activities as putative
virulence factors in clinical isolates of Aspergillus species. J Basic Microbiol 2008; 48:331-337.
2- Sergeev N, Distler M, Vargas M, Chizhikov V, Herold KE, Rasooly A. Microarray analysis of Bacillus cereus group
virulence factors. J Microbiol Methods 2006; 65:488-502.
3- Xu S, Cai L, Zhao L, Douhan-Håkansson L, Kristjánsson G, Pauksen K, et al. Tissue localization and the
establishment of a sensitive immunoassay of the newly discovered human phospholipase B-precursor (PLB-P). J
Immunol Methods 2010; 353:71-77.
4- Leon C, Taylor R, Bartlett KH, Wasan KM. Effect of heat-treatment and the role of phospholipases on Fungizoneinduced
cytotoxicity within human kidney proximal tubular (HK-2) cells and Aspergillus fumigatus. Int J Pharm 2005;
14:211-218.
5- Ganendren R, Carter E, Sorrell T, Widmer F, Wright L. Phospholipase B activity enhances adhesion of Cryptococcus
neoformans to a human lung epithelial cell line. Microbes Infect 2006; 8:1006-10015.
6- Ganendren R, Widmer F, Singhal V,Wilson C, Sorrell T, Wright L. In vitro antifungal activities of inhibitors of
phospholipases from the fungal pathogen Cryptococcus neoformans. Antimicrob Agents Chemother 2004; 48:1561-
1569.
7- Djordjevic JT, Del Poeta M, Sorrell TC, Turner KM, Wright LC. Secretion of cryptococcal phospholipase B1
(PLB1) is regulated by a glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor. Biochem J 2005; 389:803-812.
8- Rementeria A, López-Molina N, Ludwig A, Vivanco AB, Bikandi J, Pontón J, et al. Genes and molecules involved
in Aspergillus fumigatus virulence. Rev Iberoam Micol 2005; 22:1-23.
9- Widmer F,Wright LC, Obando D, Handke R, Ganendren R, Ellis DH, et al. Hexadecylphosphocholine (miltefosine)
has broad-spectrum fungicidal activity and is efficacious in a mouse model of cryptococcosis. Antimicrob Agents
Chemother 2006; 50:414-421.
10- Ma L, Xie L, Dong X, Shi W. Role of extracellular phospholipase B of Candida albicans as a virulent factor in
experimental keratomycosis. Curr Eye Res 2009; 34:761-768.
11- Schofield DA, Westwater C, Warner T, Nicholas PJ, Paulling EE, Balish E. Hydrolytic gene expression during
oroesophageal and gastric candidiasis in immunocompetent and immunodeficient gnotobiotic mice. J Infect Dis 2003;
188:591-599.
12- Ghannoum MA. Potential role of phospholipases in virulence and fungal pathogenesis. Clin Microbiol Rev 2000;
13:122-143.
13- Theiss S, Ishdorj G, Brenot A, Kretschmar M, Lan CY, Nichterlein T, et al. Inactivation of the phospholipase B
gene in wild-type Candida albicans reduces cell-associated phospholipase A2 activity and attenuates virulence. Int J
Med Microbiol 2006; 296:405-420.
14- Mukherjee PK, Seshan KR, Leidich SD, Chandra J,Cole GT, Ghannoum MA. Reintroduction of the PLB1 gene into
Candida albicans restores virulence in vivo. Microbiology 2001; 147:2585-2597.
15- Shen DK, Noodeh AD, Kazemi A, Grillot R, Robson G, Brugère JF. Characterisation and expression of
phospholipases B from the opportunistic fungus Aspergillus fumigatus. FEMS Microbiol Lett 2004; 1:87-93.
16- Singh J, Ranganathan R, Hajdu J. Kinetics of bacterial phospholipase C activity at micellar interfaces: effect of
substrate aggregate microstructure and a model for the kinetic parameters. J Phys Chem B 2008; 112:16741-16751.
17- Cronin UP, Wilkinson MG. Monitoring growth phase-related changes in phosphatidylcholine-specific
phospholipase C production, adhesion properties and physiology of Bacillus cereus vegetative cells. J Ind Microbiol
Biotechnol 2008; 35:1695-16703.
18- Reader U, Brode P. Rapid preparation of DNA from filamentous fungi. Lett Appl Microbiol 1985; 1:17-20.
19- Tavares AH, Silva SS, Bernardes VV, Maranhão AQ, Kyaw CM, Poças-Fonseca M, et al. Virulence insights from
the Paracoccidioides brasiliensis transcriptome. Genet Mol Res 2005; 4:372-389.
20- Plotkin I, Mathov I, Squiquera L, Leoni J. Arachidonic acid released from epithelial cells by Malassezia furfur
phospholipase A(2): a potential pathophysiologic mechanism. Mycologia 1998; 90:163-169.
21- Birch M, Denning DW, Robson GD. Comparison of extracellular phospholipase activities in clinical and
environmental Aspergillus fumigatus isolates. Med Mycol 2004; 42:81-86.
22- Okino N,Ito M. Ceramidase enhances phospholipase C-induced hemolysis by Pseudomonas aeruginosa. J Biol
Chem 2007; 282:6021-6030. 
23- Ghannoum MA. Potential role of phospholipases in virulence and fungal pathogenesis. Clin Microbiol Rev 2000;
13:122-143.
24- Renesto P, Dehoux P, Gouin E, Touqui L, Cossart P, Raoult D. Identification and characterization of a
phospholipase D-superfamily gene in rickettsiae. J Infect Dis 2003; 188:1276-1283.
25- Eckmann L, Reed SL, Smith JR, Kagnoff MF. Entamoeba histolytica trophozoites induce an inflammatory cytokine
response by cultured human cells through the paracrine action of cytolytically released interleukin-1. J Clin Invest 1995;
96:1269 -1279.
26- Balderas-Renteria I, García-Lázaro JF, Carranza-Rosales P, Morales-Ramos LH, Galan-Wong LJ, Muñoz-Espinosa
LE. Transcriptional upregulation of genes related to virulence activation in Entamoeba histolytica. Arch Med Res 2007;
38:372-379.
27- Bos MP, Tefsen B, Voet P, Weynants V, van Putten JP, Tommassen J. Function of neisserial outer membrane
phospholipase A in autolysis and assessment of its vaccine potential. Infect Immun 2005; 73:2222-2231.
28- Angelakopoulos H, Loock K, Sisul DM, Jensen ER, Miller JF, Hohmann EL. Safety and shedding of an attenuated
strain of Listeria monocytogenes with a deletion of actA/plcB in adult volunteers: a dose escalation study of oral
inoculation. Infect Immun 2002; 70:3592-3601.