بررسی ماندگاری گرافت غضروفی با افزودن دگزامتازون به محیط های نگهداری در نمونه های حیوانی

مقدمه

غضروف نوعی بافت همبنداز منشا مزانشیم است که از کندروسیت ها و ماتریکس خارج سلولی تشکیل شده است. یک بافت منحصر به فرد با میزان متابولیسم پایین به دلیل پراکندگی جمعیت سلولی و ساختار بدون عروق است.

غضروف بافتی زنده و حاوی سلول است و سلول های تشکیل دهنده آن راکندروسیت^[1] مینامند. این سلول ها بر خلاف بسیاری بافت های دیگر با فاصله نسبتا زیادی از یکدیگر قرار گرفته اند و بین آنها را ماتریکس بین سلولی که عمدتا ازآب (تا 70% )گلیکوزآمینوگلیکان ها(کوندرویتین سولفات وهیالورونیک اسید) و گلیکو پروتیین ها مانند اگریکان تشکیل شده پر کرده است. کندروسیت ها در حفره هایی به نام لاکونا^[2] قرار گرفته اند.

فعالیت گلیکولیتیک و مصرف اکسیژن غضروف تقریبا معادل شرایط بی هوازی است و مواد غذایی از طریق انتشار به این بافت می رسند (1). به دلیل اینکه غضروف فاقد شبکه عروقی داخلی است بر خلاف استخوان قابلیت رژنراسیون وسیع ندارد و در نتیجه قادر به ترمیم و بازسازی نیست (2). بنابراین آسیب غضروف غالبا باعث ایجاد اسکار و از دست رفتن دائمی عملکرد آن می شود.( 3)

با توجه به غالب بودن نوع رشته شرکت کننده در ساختمان ماتریکس غضروف سه نوع غضروف وجود دارد: غضروف فیبرو الاستیک و هیالن.

این خصوصیات منحصر به فرد باعث شده است که استفاده از گرافت های غضروفی یکی از ارکان اساسی در جراحی های ترمیمی و زیبایی باشد.از آنجا که استفاده از غضروف اتولوگوس مزایای متعددی مانند ریسک پایین عفونت و اکسپوز شدن در مقایسه با مواد مصنوعی دارد ، امروزه استفاده از غضروف اتولوگ انتخاب اول جراحان پلاستیک است.

در مواردی که بیمار نیاز به جراحی اصلاحی و revision در مراحل بعدی داشته باشد نگهداری این غضروف ها در محیط مناسب می تواند به عنوان منبع مفیدی در جراحی های بعدی باشد(4).

در باره محیط مناسب نگهداری گرافت غضروفی مطالعات متعددی انجام شده است اما این مطالعات غالبا محدود بوده و مقایسه وسیع بین این محیط ها در دسترس نیست. این مسئله سوالات متعددی را در ذهن پژوهشگر مطرح کرد تا با بررسی دو محیط نگهداری متفاوت، ماندگاری سلول های غضروفی در این محیط ها را بیازماید. نگهداری گرافت درشرایط مناسب میتوانداستفاده ازآنهارادراعمال جراحی بعدی مقدورسازد. درحال حاضرجراحان این گرافتهارادرمحیط های متفاوتی نگهداری می کنند واین درحالی است که اطلاعات دقیقی درموردمیزان ماندگاری کندروسیتهادردسترس نیست. امروزه اتانل 70 % شایع ترین محیط مورد استفاده برای نگهداری گرافت های غضروفی است.

در برخی مطالعات نشان داده شده که اضافه کردن دگزامتازون به محیط های کشت سلولی می تواند با اثر ضد التهابی منجر به نگهداری بهتر ساختار های سلولی شود.هر چند این مطالعات عمدتا در محیط های کشت سلولی انجام شده و بررسی در مورد میزان ماندگاری سلول ها در محیط های نگهداری گرافت های غضروفی حاوی دگزامتازون در دسترس نیست.

دگزامتازون نوعی استروئید سنتتک آدرنال است که اثرات ضد التهابی قوی داردو در درمان طیف وسیعی از اختلالات التهابی مانند آرتریت روماتویید استفاده می شود(5). وزن مولکولی آن 392/461 g/m است.

دگزامتازون دارای یک اثر محافظتی در برابر فاکتور های موثر در تخریب ساختار غضروفی سلول است.(6) از سوی دیگر نشان داده شده است که دگزامتازون باعث القای بیان فاکتورهای رشد آنابولیک وتمایز سلولی می شود (7).

در مطالعه ای که توسط بین^[3] و همکارانش در نیویورک در سال 2010 انجام شده اضافه کردن 10 میکرو مول دگزامتازون به محیط های نگهداری منجر به سرویوال بهتر نمونه ها در محیط های کشت سلولی شده است (8).

استفاده از غضروف های برداشته شده از سپتوم که در نرمال سالین و آنتی بیوتیک ویا محلول های الکلی نگه داری شده اند برای جراحی های اصلاحی بعدی اقدامی شایع است (9و10).

با بررسی این متون می توان به این نتیجه رسید که یک بررسی مقایسه ای درباره تاثیر افزودن دگزامتازون به محیط های نگهداری انجام نشده است و طراحی یک مطالعه با در نظر گرفتن این فاکتور می تواند راه کار مفیدی برای نگهداری مناسب تر آلوگرافت ها فراهم کند.

در مورد دمای مناسب جهت نگهداری گرافت ها دو پیشنهاد اصلی نگهداری در حالت منجمد و نگهداری در دمای 4 درجه سانتی گراد است. در مطالعه ای که آولینا^[4] و همکارانش درمکزیکودر سال 2006انجام دادند نشان دادندکه نگهداری در شرایط cryopreserved می تواند منجر به اسیب شدید سلول ها در نتیجه انجماد اب درون سلولی شده و در نتیجه viability سلول های غضروفی کاهش می یابد.(11)

 برایتون^[5] و همکارانش نشان دادند که نگهداری محیط کشت غضروفی در دمای 4 درجه سانتی گراد در حال حاضرمناسب ترین شرایط نگه داری غضروف است (12).

در مواردی که نیاز به استفاده از گرافت های استئو کندرال ذخیره شده وجود دارد باقی ماندن این گرافت ها منوط به باقی ماندن متابولیسم کندروسیت ها است و این متابولیسم است که زنده ماندن گرافت وبقای ان را تضمین می کند (13).

روش کار

پژوهش روی20 خرگوش سفید نژاد نیوزلندی که از موسسه رازی خریداری شد و در مرکز حیوانات آزمایشگاهی بیمارستان امام خمینی در سال 1393 انجام گرفت. جنس همه خرگوش‌ها مذکر و سن تمام آنها یکسان، فاقد بیماری و وزن تمام آنها حدود 1200 تا 1400 گرم می باشد.

تمام خرگوش‌هابراساس توصیه‌های“Guide of the care and use of labaratory animals”, 7th edition Published by the NRC 1997, ARENA/OLAW, Institutional Animal Care and Use Committee Guide Book, 2nd Edition 2002 نگهداری شدند.

 تمام خرگوش‌ها با دارو های کتامین 10% با دوز mg/kg 90 و زایلازاین2% با دوزmg/kg  9 تولید شرکت دارویی دارو گستر به صورت داخل عضلانی بیهوش شدند و در صورت نیاز دوز داروها تکرار می شدند.عملیات بی هوش کردن و آماده سازی حیوانات توسط کاردان آزمایشگاه مرکز حیوانات آزمایشگاهی انجام شد.

 سپس موهای قسمت خلف گوش با دستگاه تراش برقی تراشیده شده و محل با محلول بتادین و الکل ضد عفونی شد. پس از آن آنتی بیوتیک پروفیلاکسی با سفازولین داخل عضلانی و به مقدار mg/kg 60 شرکت تولید دارو تزریق شد.

 بعد از اطمینان از عمق بیهوشی با تست Withdrawal Pinch Flexion عمل جراحی با رعایت روش‌‌های Asepsis شروع شد. غضروف گوش خرگوش پس از آزاد سازی فلپ ساب کوتانئوس برذاشته شده و به صورت بلوک های یک در یک سانتی متر با حفظ پری کندریوم آماده و عملیات آماده سازی گرافت ها ی غضروفی توسط پژوهشگر انجام شد.

نمونه های به دست آمده در دو محیط نگهداری متفاوت شامل اتانل 70 ، با و بدون اضافه کردن دگزامتازون با غلظت 10 میکرو مول آماده و نگه داری شدند.

شش بلوک غضروفی به صورت تازه جهت داشتن نمونه پاتولوژی پایه تحویل آزمایشگاه پاتولوژی شد.

 اتانل 70 ،(CH3CH2OH) از شرکت جهان شیمی تهیه شد. جهت تهیه محیط های حاوی دگزامتازون ، دگزامتازون با غلظت 10میکرو مول تولید شرکت تولید دارو توسط پژوهشگر به محیط های فوق اضافه شد.

همه نمونه ها در انکوباتور با دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شده و 45 روز و 90 روز بعد توسط یک سیتوپاتولوزیست در بخش پاتولوژی بیمارستان امام خمینی بررسی شد.

نمونه ها تحت برررسی با رنک آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین قرار گرفته و زنده بودن کندروسیت ها در نمونه ها با مطالعه میکروسکوپی ارزیابی شد. درصد کندروسیت های زنده به وسیله سلول های زنده حاوی لاکونا همراه با هسته وفقدان نمای دژنراسیون, نکروز, کاریورکسیس و کاریولیز مشخص شد. در مرحله بعدی نتایج ارزیابی آماری شده و میزان ماندگاری کندروسیت ها در هر محیط مشخص شد.

نمونه ها پس از آماده سازی و به صورت شماره گذاری شده ویک سویه کور تحویل باتولوژیست شد.تمام نمونه ها جهت بررسی هیستوباتولوژی در بلوک های بارافینی قرار گرفت.دو برش بافتی در هر اسلاید از هر نمونه با ضخامت ۳ میکرومتر بدست آمده و سبس به روش هماتوکسیلین و ائوزین رنگ آمیزی شد.

جهت تعیین درصد کندروسیت های زنده تمام برش ها با میکروسکوپ اسکن شده و ۱۵۰ لاکونای کندروسیت در هر برش ارزیابی شد.(۳۰۰ لاکونا در هر اسلاید) تعداد کندروسیت ها با مورفولوژی نرمال بدون تغییرات دژنراتیو واضح (شامل کاریولیز هسته و کاریورکسیس) در میان این۳۰۰لاکوناشمارش شده ودرصدکندروسیتهای زنده درهرنمونه اندازه گیری شد. همچنین درصدمتوسط کندروسیت های زنده از از هر گروه تعیین شد.(تصویر1).

نتایج

این مطالعه با بررسی مقایسه ای ماندگاری کندروسیت ها در محیط اتانل با و بدون افزودن 10 میکروگرم در لیتر دگزامتازون  نشان داده است که میزان کندروسیتهایزنده گرافت غضروفی در

جدول 1- نتایج میزان ماندگاری کندروسیت ها در محیط اتانل با و بدون دگزامتازون در روز چهل و پنجم

روز چهل و پنجم در محیط اتانل 23/9±29/77 بوده است. این بررسی نشان داد که در محیط اتانل همراه با دگزامتازون ماندگاری کندروسیت ها در روز چهل و پنجم 71/10±42/89 بوده است  (04/0p=)(جدول و نمودار 1).

همچنین بررسی ما نشان داده است که در نودمین روز در محیط اتانل30/9±79/71 کندروسیت ها زنده مانده اند. این بررسی نشان داد که در روز نود ام در محیط اتانل همراه با دگزامتازون 73/10±50/83 کندروسیت ها زنده مانده اند (06/0p=). (جدول و نمودار 2) هر گروه تعیین شد.(شکل 1)

بحث

نگهداری گرافت درشرایط مناسب میتوانداستفاده ازآنهارادراعمال جراحی بعدی مقدورسازد. کوینگ[6] در اواخر قرن 19 برای اولین بار استفاده از گرافت های غضروفی را در جراحی پلاستیک مطرح کرد (14).  ژاکژوزف[7] (1865-1936) نخستین بارعمل رینوپلاستی زیبائی رادریازدهم ماه می سال 1898 انجام داد. روش اکسیزیون وکاهش ابعادبینی درآغازقرن بیستم معرفی شدوبرای بیش از 60 سال تکنیک استاندارد رینوپلاستی بود.  پس از آن تمایل به تقویت ساختار های بینی با استفاده ازگرافت اسپردر،گرافت تیپ ورادیکس توسط   کنستانتین[8]  و شین[9]  پیشنهاد گردید.(15و16)

در مطالعه ای که آولینا[10]و همکارانش درمکزیکودر سال 2006انجام دادند نشان دادندکه نگهداری در شرایط cryopreserved می تواند منجر به اسیب شدید سلول ها در نتیجه انجماد اب درون سلولی شده و در نتیجه t سلول های غضروفی کاهش می یابد.(11)درحال حاضرجراحان این گرافتهارادرمحیطهای متفاوتی نگهداری می کنندواین درحالی است که اطلاعات دقیقی در مورد میزان ماندگاری کندروسیتهادردسترس نیست.

نگرانی های اصلی درباره غضروف های نگه داری شده شامل موارد زیر است : حفظ حجم در غضروف نگه داری شده در مقایسه با غضروف تازه ، تفاوت در میزان جذب غضروف ها ی نگه داری شده در مناطق مختلف بینی، دستورالعمل ها و استاندارد ها برای نگه داری غضروف، میزان موفقیت غضروف های له شده در مقابل غضروف های سالم (17).

میزان جراحی های revision بستگی به تجربه جراح و مهارت او دارد و می تواند در بازه 5 تا 100 درصد باشد.از آنجا که اکثریت جراحی های اصلاحی نیاز به گرافت غضروفی دارند هر روشی که نیاز به برداشت مجدد غضروف را از بین ببرد مطلوب است(18و19و20) نگه داری غضروف اضافی سپتوم در یک فضای ساب کوتانئوس در پشت گوش هم به عنوان یک روش توصیه شده است. هرچند جراحی revision در 20 % بیماران رینوپلاستی اجباری است. بنا براین 80 درصد دیگر تحت جراحی غیر ضروری قرار می گیرند. علاوه بر آن برداشت گرافت ذخیره شده به زمان جراحی اضافه کرده و نقطه دیگری از بدن را هم آسیب می زند. در مطالعه  رادرمن[11] و همکارانش در سال  1994 ، نشان داده شد که میزان موفقیت غضروف اتوژن نگهداری شده به این روش با غضروف تازه برابر است (21).

در مورد دمای مناسب جهت نگهداری گرافت ها دو پیشنهاد اصلی نگهداری در حالت منجمد تازه و نگهداری در دمای 4 درجه سانتی گراد است. در مواردی که بیمار نیاز به جراحی اصلاحی و revision در مراحل بعدی داشته باشد نگهداری این غضروف ها در محیط مناسب می تواند به عنوان منبع مفیدی در جراحی های بعدی مورد استفاده قرار گیرد (4). در برخی مطالعات نشان داده شده که اضافه کردن دگزامتازون به محیط های کشت سلولی می تواند با اثر ضد التهابی منجر به نگهداری بهتر بافت غضروفی شود. در مطالعه ای که توسط بین و همکارانش در نیویورک در سال 2010 انجام شده اضافه کردن 10میکرو مول دگزامتازون به محیط های کشت سلولی منجر به سرویوال بهتر نمونه ها شده است (8). مطالعه ما با هدف بررسی افزودن دگزامتازون به محیط های نگهداری نشان داده است که میزان کندروسیتهایزنده گرافت غضروفی در رروز 45 ام در محیط اتانل 23/9±29/77 و در محیط اتانل +دگزامتازون متازون 71/10±42/89 گزارش شده است (04/0p=).

 همچنین این بررسی نشان داده است که میزان کندروسیتهای زنده گرافت غضروفی در رروز 90 ام در محیط اتانل71.79±9.30  و در محیط اتانل +دگزامتازون متازون 73/10±50/83گزارش شده است (06/0p=).

در این بررسی به نظر میرسد اتانول همراه با دگزامتازون محیط پایاتری برای کندروسیتهای گرافت غضروفی باشد. بنا بر این

افزودن دگزامتازون به شایع ترین محیط نگهداری گرافت غضروفی یعنی اتانل 70 درصد می تواند باعث ماندگاری بهتر کندروسیت ها و حفظ بهتر ساختار گرافت شود.

نتیجه گیری

از آنجا که استفاده از غضروف اتولوگوس مزایای متعددی مانند ریسک پایین عفونت و اکسپوز شدن در مقایسه با مواد مصنوعی دارد ، امروزه استفاده از غضروف اتولوگ انتخاب اول جراحان پلاستیک است. این مطالعه نشان داد که نگهداری گرافت غضروفی در اتانل 70 درصد با اضافه کردن 10 میکرومول دگزامتازون و دمای 4 درجه سانتی گراد می تواند با ماندگاری بالای کندروسیت ها برای جراحی های بعدی منبعی قابل دسترسی باشد.