Isolation of tetD, tetC, tetB, tetA‎ genes from Acinetobacter bummani samples isolated from hospital samples by multiplex PCR method

Document Type : Research Paper

Authors

1 Department of Microbiology, Sirjan Branch, Islamic Azad University, Sirjan, Iran.

2 Assistant Professor, Department of Microbiology, School of Basic Sciences, Saveh Branch, Islamic Azad University, Saveh, Iran

Abstract

Introduction: Acinetobacter is a gram negative bacterium seen as cocci or cocobacilli. This opportunistic ‎bacterium plays a very important role in hospital infections. Tetracycline is a broad-spectrum ‎antibiotic that inhibits the growth of many gram-positive and negative bacteria. Today, antibiotic ‎resistance is not responding to the frequency of pathogenic bacteria and the risk of antibiotic ‎resistant strains. The aim of this study was to determine the prevalence of antibiotic resistance and ‎the distribution of tetracycline (tetD, tetC, tetB, tetA) genes in Acinetobacter bummani and ‎antibiotic resistance Disc diffusion.‎
Subjects & Methods: Acinetobacter bummani were isolated from clinical specimens and then identified by using bacteriological and biochemical tests. An antibiotic test was performed using CLSI standard method. By the PCR method, was investigated the presence of tetracycline resistance genes.
Results: The highest resistance to acinetobacter isolates was resistance to ciprofloxacin. Out of 60 isolates of acinetobacter, the prevalence of tetA, tetB, tetC and tetD genes was 91.6, 91.6, 15, and 0%, respectively. This study concludes that resistance genes are present whether or not resistance genes are susceptible to many antibiotic groups.
Conclusion: The main mechanisms for resistance to tetracycline are through the acquisition of the tet gene with the activity of the phallus pumps, ribosomal protection and enzymatic inactivation. An antibiotic resistance can be prevented by identifying antibiotic resistance patterns and using appropriate antibiotics when there is a need for treatment and preventing the release of resistant strains in the community among human populations.

Keywords

Full Text

مقدمه

اسینتوباکتر جزء باکتری‌های گرم‌ منفی، هوازی، غیرتخمیری که به صورت کوکسی یا کوکوباسیل هستند و قدرت تخمیر ندارند. این باکتری‎ها نیازمندی‌های غذایی کمی برای رشد داشته و می‌توانند در شرایط نامساعد، سطوح خشک و همچنین محیط آبی به مدت طولانی زنده بمانند. اسینتوباکتر بومانی به ندرت عامل عفونت‌های سخت در افراد با سطح ایمنی طبیعی می‌باشد، همچنین کمتر به عنوان فلور طبیعی بدن شخص سالم شناخته شده است. جنسAcinetobacter   اولین بار در سال 1911 توسط بایرینک  معرفی شد. طی چند دهه اخیر باکتری‎هایی که امروزه در جنس Acinetobacter  قرار می‎گیرند (1). اسینتوباکتر بومانی یک پاتوژن فرصت طلب درحال گسترش است که گروه‎های مختلفی از مردم، به ویژه بیماران بستری دربخش مراقبت‎های ویژه ICU را تحت تاثیر قرار می‎دهد. عفونت‎های ناشی از این باکتری شامل عفونت‎های مجاری ادراری، عفونت‎های زخم، مننژیت، اندوکاردیت، پریتونیت، عفونت پوست و بافت نرم می­باشد. ریسک فاکتورهای متعدد مستعد کننده عفونت با این باکتری شامل بستری طولانی مدت در بیمارستان، نقص ایمنی، اعمال جراحی، تماس طولانی با بیماران کلونیزه شده، سوختگی، کهولت سن، مصرف عوامل آنتی باکتریال وسیع الطیف و وجود وسایل تهاجمی مثل کاتتر می­باشند. درمان عفونت‎های ناشی از این باکتری به طور معمول شامل استفاده از بتالاکتام‎ها و فلوروکینولون‎ها می‎باشد که در سال‎های گذشته افزایش استفاده از این آنتی بیوتیک‎ها منجر به ظهور سویه‎های مقاوم شده است (2). مقاومت آنتی بیوتیکی اسینتوباکتر بومانی به واسطه مکانیسم‎های اکتسابی و ذاتی است که این مکانیسم‎ها شامل تغییر آنزیمی، موتاسیون در ژن‎های هدف، تغییر نفوذ پذیری غشای خارجی و افزایش بیان ایفلاکس پمپ‎ها می‎باشد. عفونت با سویه‎های مقاوم به چند دارو (MDR)، یعنی سویه‎هایی از اسینتوباکتر بومانی که به سه کلاس آنتی بیوتیکی رایج مقاوم باشند (3)  همچنین سویه‎هایی از اسینتوباکتر بومانی که علاوه بر مقاومت به سه کلاس آنتی بیوتیکی رایج، به ایمی پنم نیز مقاوم باشند، XDR2  گفته می‎شود، که مشکلات درمانی بسیاری ایجاد نموده است و سبب شده درمان عفونت‎های مربوط به این باکتری مشکل شده و همراه با افزایش طول مدت بستری و افزایش هزینه‎های درمانی، پیش آگهی نامطلوب و مرگ و میر بیشتری نسبت به سویه‎های حساس شود (4). در گذشته از روش‌های فنوتیپی مثل سروتیپ، بیوتیپ، روش‌های برش آنزیمی و آنالیز پلاسمید استفاده می‌شد، اما امروزه روش‌های ژنوتیپی مانند PFGE، روش‌های مبتنی بر PCR مانند REP-PCR، PCR-RFLP، AP-PCR، Multiplex-PCR و غیره جایگزین روش‌های فنوتیپی شده‌اند (5). در مطالعه حاضر به تعیین هویت مولکولی کلاس­های مختلف ژن‎های مقاومت به تتراسایکلین در اسینتوباکتر بومانی جدا شده از خون، ترشحات تنفسی، ادرار، زخم پوست پرداخته می­شود و  از نظر میزان حضور کلاس‎های مختلف این ژن‎ها در اسینتوباکتر بومانی  وکارایی روش نوین ‏ملکولی وجود دارند. آگاهی از گونه‎های اسینتوباکتر ‏بومانی مقاوم ‏به دارو دارای اهمیت فراوانی می‎باشد. جلوگیری از ضرر و زیان اقتصادی ناشی از بیماری اسینتوباکتر بومانی کنترل و پیشگیری از بیماری و استفاده از آن در جهت تشخیص آزمایشگاهی و در اپیدمیولوژی‎های سنگین ضرورت دارد که از یک روش سریع برای تشخیص به هنگام و دقیق سویه‎ها و پاتووارها در ارتباط با عامل بیماری‎زا استفاده شود. لذا این مطالعه باهدف جداسازی ژن‎های tetA،tetB،tetC  اسینتوباکتر بومانی توسط Multiplex PCR انجام شد.

 

 

روش کار

مطالعه حاضر در سال 1396 در بیمارستان شهید افضلی پور کرمان انجام شده است. نوع مطالعه توصیفی بوده و نمونه­های اسینتوباکتر بومانی از نمونه‌های جمع‌آوری شده از خون، ترشحات تنفسی، ادرار، زخم پوست انجام گرفت. نمونه‎ها از بیمارانی که حداقل به مدت سه روز در بیمارستان‌ بستری بوده و عفونت را در محیط بیمارستان کسب کرده بودند جمع‌آوری شد (6-7).کشت، جدا سازی و تأیید بیوشیمیایی جدایه‎های اسینتوباکتر بومانی در محیط‎های مک­کانکی (مرک، آلمان) و با تست‎های بیوشیمیایی صورت گرفت. DNA  نمونه­ها با کیت تجاری استخراج و  انجام آزمایش PCR نمونه‎‌ها جهت شناسایی ژن‎های مقاومت آنتی بیوتیکی و نیز انجام تست آنتی بیوگرام بر روی نمونه‎ها صورت پذیرفت (8-9).

تعیین الگوهای مقاومت آنتی بیوتیکی سویه‌های اسینتوباکتر بومانی به روش دیسک دیفیوژن

دیسک­های آنتی بیوتیک :در این آزمایش از دیسک‎های آنتی بیوتیکی بر اساس استانداردهای2011 CLSI استفاده شد. علاوه بر این انتخاب آنتی بیوتیک طبق مطالعه مقالات مختلف و فراوانی استفاده از آن‎ها در بیمارستان‎ها صورت گرفت، این آنتی بیوتیک‎ها شامل آمپی سیلین(µg 10)، تتراسایکلین(µg 10)،تریمتوپریم/سولفامتوکسازول(µg25)، یپروفلوکساسین(µg 30)، نالیدیکسیک اسید(µg 30)، جنتامایسین(µg10)، استرپتومایسین (µg 10)و کلرامفنیکل(µg 10) می‎باشند. این آنتی بیوتیک‎ها از شرکت پادتن طب تهیه شد (10-11).

استخراج DNA :به منظور استخراج DNA باکتری از کیت استخراج DNA (کیت ذخایر مرکز ژنتیک ایران) استفاده شد.پس از جستجو در مقالات مختلف  پرایمرهای مناسب برای ژن‎های tetانتخاب شدند.پرایمرها در سایت  http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi  مقایسه و بلاست شدند و به شرکت ماکروژن سفارش داده شد. پرایمرها توسط آب مقطر دیونیزه به غلظت 100 پیکومول و سپس به غلظت مناسب که 10پیکومول بود، رسانده شدند. در جدول 1 توالی پرایمر و طول قطعه تکثیری آورده شده است (12).

واکنش Multiplex PCR : مقادیر مواد PCR برای هر واکنش شامل 10 میکرولیتر PCR Master Mix 2x (Amplicon)، 8/0میکرولیتر از هرکدام یک از پرایمر ها با غلظت 10 پیکومول بر میکرولیتر و 4 میکرولیتر از DNA الگو (150 نانوگرم) بود. مراحل دمایی واکنش PCR بدین شکل انجام شد که ابتدا مرحله دناتوراسیون اولیه در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه، 35 چرخه شامل دناتوراسیون 95 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه، مرحله اتصال پرایمر در دمای 55 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه و مرحله تکثیر در دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت 1 دقیقه، و پس از 35 چرخه مرحله تکثیر نهایی در دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه انجام پذیرفت. الکتروفورز محصولات PCR یا DNA با ژل آگاروز : برای الکتروفورز DNA از ژل آگاروز 5/1% استفاده می‌شود. قطعات DNA حاصل از استخراج یکسان نبوده و دارای طول‎های متفاوتی می‎باشند که اندازه قطعات ماده ژنتیکی اهمیت دارد و جهت جداسازی آن‎ها از دستگاه الکتروفورز استفاده می‎شود.

نتایج

بررسی مقاومت‎های آنتی بیوتیکی: به منظور بررسی مقاومت‎های آنتی بیوتیکی سویه­ها، آنتی بیوگرام با روش دیسک دیفیوژن انجام شد و میزان درصد حساسیت و مقاومت کلیه سویه‎ها به آنتی بیوتیک‎های مورد نظر مشخص شد. نتایج مقاومت نمونه‏ها برای هر آنتی بیوتیک در جدول 2 قابل مشاهده است. این نتایج نشان داد که تمامی ایزوله‎ها به استرپتومایسین و نالیدکسیک اسید مقاوم بودند. در مرحله بعد بیشترین مقاومت مربوط به آنتی بیوتیک تتراساکلین و میران مقاومت به تریمتوپریم‎سولفامتاکسازول 3/58%، کلرامفنیکل 3/48% بود. هیچ مقاومتی نسبت به سیپروفلوکساسین مشاهده نشد.

نتایج آزمونMultiplex PCR : با توجه به نتایج بدست آمده از مجوع 60 نمونه استینوباکتر، 6/91 % از سویه‎ها ( 55 سویه) واجد ژن tet-A ، 6/91 % سویه‎ها (55سویه) واجد ژن tet-B، 15% سویه‎ها (9 سویه) واجد ژن tet-C و 0%  سویه‎ها (0 سویه) واجد ژن tet-D بودند. نتایج در نمودار 1  قابل مشاهده است. نتایج مربوط به PCR ژن‎های tet در شکل شماره 1 آورده شده است.

بحث

اسینتوباکتر بومانی کوکوباسیل گرم منفی و عامل عفونت‎های مختلف بیمارستانی می‎باشد که در محیط بیمارستان پراکنده بوده و مدت زمان زیادی زنده می‎ماند و به راحتی در میان بیماران منتقل می‎گردد. امروزه به علت خاصیت کلینیکی قابل توجه آن در کسب مقاومت داروئی، به عنوان یکی از میکروارگانیسم‎های تهدید کننده نسبت به درمان با داروهای ضد میکروبی در نظر گرفته می‎شود. در بین باکتری‎های غیر تخمیری که به طور عمده از نمونه‎های انسانی جدا می‎شوند، اسینتوباکتر بومانی در رتبه دوم قرار دارند ( سودوموناس در رتبه اول قرار دارد). از میان باکتری‎های جنس آسینتوباکتر، گونه‎های اسینتوباکتر بومانی (Acinetobacter baumannii)به طور عمده از نمونه‎های انسانی ایزوله می‎شوند (13). آمار ارائه شده توسط مرکز کنترل و پیشگیری عفونت­ها Centers for Disease Control and prevention (CDC) نشان می­دهد که اسینتوباکتر بومانی عامل ایجاد کننده‎ی 4/2% عفونت خون بیمارستانی در بخش‎های مراقبت ویژه، 1/2% عفونت زخم‎های جراحی، 9/6% از پنومونی‎های بیمارستانی و 6/1% از عفونت مجرای ادراری بیمارستانی در بیمارستان‎های امریکا بوده است. عفونت با آسینتوباکتر بومانی دارای عوارض جانبی کلینیکی بوده که شامل: طولانی شدن زمان بستری و افزایش هزینه‎های درمانی و مرگ و میر بالا می‎باشد (14). در مطالعه‎ای که توسط Choi و همکاران در سال 2005 انجام شد میزان مرگ و میر در افرادی که مبتلا به عفونت با اسینتوباکتر بومانی بودند 4/45% گزارش شد . به دلیل اینکه ایزوله‎های کلینیکی اسینتوباکتر بومانی غالبا به اکثر مواد ضد میکروبی مورد استفاده در درمان مقاوم می‎باشند، شکست درمان و مرگ و میر در عفونت‎های ایجاد شده توسط این باکتری معمول است (15). توکل مرضیه و همکاران،1394 مطالعات زیادی در زمینه مقاومت استینوباکتر صورت گرفته از جمله اینکه مطالعه توصیفی در دو بیمارستان شهر تهران بر روی 121 ایزوله اسینتوباکتر بومانی جدا شده از عفونت‎های بالینی انجام شد. پس از شناسایی ایزوله‎ها با استفاده از روش‎های بیوشیمیایی، الگوی مقاومت آنتی بیوتیکی ایزوله‎ها به دو روش انتشار دیسک و روش مولکولی (برای ردیابی ژن‎های کد کننده مقاومت آنتی بیوتیکی) تعیین شد. از تعداد 121 ایزوله اسینتوباکتر بومانی جدا شده از نمونه‎های عفونی، بیش‎ترین مقاومت به آنتی بیوتیک تتراسایکلین با فراوانی 9/90% و بیش‎ترین حساسیت به آنتی بیوتیک‎های کلرامفنیکل، نیتروفورانتوئین و مروپنم با فراوانی 65/1 % مشاهده شد. فراوانی حضور ژن‎های dfrA1، tet (A)، aac (3) - IV، sul1، tet (B)، aadA1، qnr،CITM، blaSHV، sim، vim، Oxa-58-like، Oxa-24-like، imp، Oxa-51-like، Oxa-23-like، cat1، cmlA به ترتیب 79 (2/65 %)، 71 (6/58%)، 68 (1/56%)، 67 (3/55%)، 44 (3/36%)، 41(8/33%) ، 29 (9/23%)، 28 (1/23%)، 24 (8/19%)، 17(14%)، 16(2/132%)،  14(5/11%)، 12(9/9%)، 10(2/8%)، 9(4/7%)، 8(6/6%)، 5(1/4%) و 3 (4/2 %) بود (7) که میزان ژن tet (A) تقریبا  با نتایج این پژوهش تطابق دارد. و از طرفی افزایش فراوانی ژنtetA  و tetB در این پژوهش نشان می­دهد که مقاومت باکتری اسینتوباکتر ‏در حال افزایش است که به سبب افزایش روز از افزون از تتراسایکلین می‎باشد. درمنش و همکاران در سال 1392 ، 121 سویه اسینتوباکتر بومانی از نمونه‎های ادرار افراد مبتلا به پیلونفریت و التهاب مثانه را جمع آوری نمودند. مقاومت آنتی بیوتیکی سویه‎ها علیه 10 آنتی بیوتیک رایج با استفاده از روش دیسک گذاری ساده ارزیابی گردید. فراوانی فاکتورهای حدت در موارد پیلونفریت، pap (100 %) afa (5/97 %) hly (95 %) sfa (95 %) و در موارد التهاب مثانه pap (7/72 %) afa (6/63 %) hly (4/45 %) بدست آمد. ژن‎های مقاومت به جنتامایسین (7/96 %) و بتالاکتام ها (7/88 %) و تتراسایکلین (tet) (2/82 %) بیشترین فراوانی را در جدایه­های باکتری داشتند (16) و میزان درصد مقاومت به تتراساکلین تقریبا با نتایج این تحقیق تطابق دارد و تفاوت‎اندک موجود به علت منابع متفاوت سویه­ها می­باشد. در اکثر موارد به علت استفاده بی رویه و خودسرانه آنتی بیوتیک‎ها، شاهد موارد زیادی از مقاومت­های داروئی در پاتوژن‎ها بوده که این خود سبب عدم موفقیت در درمان و پیدایش بسیاری از عوارض علی رغم صرف هزینه‎های زیاد درمانی می‎شود. مقاومت‎های داروئی نسبت به آنتی بیوتیک‎ها در مناطق مختلف ایران و جهان به دلیل تغییرات ژنتیکی در سویه‎های ایجاد کننده و تفاوت در میزان مصرف آنتی بیوتیک‎ها و وجود اختلاف در میزان دسترسی به­آنتی بیوتیک‎های وسیع طیف و جدید متفاوت می‎باشند. مقاومت به آنتی بیوتیک­ها (پنی سیلین و سفالوسپورین ها و کارباپنم) در حال افزایش می‎باشند. گاهی اوقات باید یک میکروب را با مصرف همزمان چند آنتی بیوتیک درمان کرد ومصرف یک آنتی بیوتیک به تنهایی یا مصرف ناقص می‎تواند مقاومت ایجاد کند. بنابراین تعیین الگوی مقاومت آنتی بیوتیکی درباکتری‎های بیماری زای شایع جهت هدایت درمان های امپریکال (تجربی) و اختصاصی علیه یک پاتوژن خاص، حایز اهمیت است (17).

نتیجه‌گیری

با توجه به نتایج به دست آمده و نتایج در گذشته مقاومت کمی به آنتی بیوتیک‌ها گزارش شده ‏بود، اما امروزه به دلیل گسترش کاست‌های ژنی مقاوم در آن‌ها مقاومت به این آنتی‌بیوتیک‌ها به ‏شدت افزایش یافته است. با توجه به اینکه ژن‎های مقاومت چندگانه می‎توانند بر روی ‏اینتگرون‎ها قرار گیرند و به سویه‎های دیگر نیز منتقل شوند بنابراین شناسایی و غربالگری ‏اینتگرون‎ها برای جلوگیری از به وجود آمدن سویه‎های دارای مقاومت چندگانه دارویی لازم و ‏ضروری می‎باشد. همچنین با تعیین الگوی مقاومت آنتی بیوتیکی و استفاده از آنتی بیوتیک‎های ‏مناسب در مواقعی که نیاز به درمان باشد نیز می‎توان از مقاومت آنتی بیوتیکی جلوگیری به عمل ‏آورد و از انتشار سویه‎های مقاوم در جامعه در بین جمعیت‎های انسانی ممانعت کرد. ‏جهت درمان قطعی و عدم بروز مقاومت‌های روزافزون در سویه‌ها پاتوژن، تعیین الگوی مقاومتی ‏و حتی ‏MIC‏ آن‌ها برای پیگیری روند مقاومت ضروری است. ‏

تشکر و قدردانی

این مقاله از پایان نامه کارشناسی ارشد میکروبیولوژی استخراج شده است و از کلیه عزیزان در گروه پژوهشی میکروب شناسی پاسارگاد و جناب آقای دکتر علیرضا مختاری صمیمانه قدردانی و تشکر می­گردد.

References

1. Murray PR, Rosenthal KS, Pfaller MA. Medical microbiology. New York: Elsevier Health Sciences; 2015. P. 632-84.
2. Nasonova E. Pulsed field gel electrophoresis: theory, instruments and applications. Tsitologiia 2008; 50:927-35.
3. Turlej A, Hryniewicz W, Empel J. Staphylococcal cassette chromosome mec (Sccmec) classification and typing methods: an overview. Pol J Microbiol 2011; 60:95-103.
4. Fagon JY, Chastre J, Domart Y, Trouillet JL, Gibert C. Mortality due to ventilator-associated pneumonia or colonization with Pseudomonas or Acinetobacter species: assessment by quantitative culture of samples obtained by a protected specimen brush. Clin Infect Dis 1996; 23:538-42.
5. Lim K, Hanifah YA, Yusof M, Thong KL. ermA, ermC, tetM and tetK are essential for erythromycin and tetracycline resistance among methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains isolated from a tertiary hospital in Malaysia. Ind J Med Microbiol 2012; 30:203-7.
6. Gilan NR, Reshadat S, Ghasemi SR. The relationship between playing computer games and aggression in guidance school students of Kermanshah (2012). J Kermanshah Univ Med Sci 2013; 17:164-71.
7. Tavakol M, Momtaz H. Detection of the most prevalent antibiotic resistance genes in Acinetobacter baumannii strains isolated from hospital infections and determination of their antibiotic resistance pattern. Biol J Microorg 2015; 4:71-82 (Persian).
8. Momtaz H, Khamesipour F, Tavakol M, Awosile B. Determination of antimicrobial resistance and resistant genes in acinetobacter baumannii from human clinical samples. West Indian Med J 2015; 66:1.
9. Tille P. Bailey & Scott's diagnostic microbiology-e-book. New York: Elsevier Health Sciences; 2013. P. 276-355.
10. Hombach M, Bloemberg GV, Böttger EC. Effects of clinical breakpoint changes in CLSI guidelines 2010/2011 and EUCAST guidelines 2011 on antibiotic susceptibility test reporting of Gram-negative bacilli. J Antimicrob Chemother 2011; 67:622-32.
11. Jorgensen JH, Turnidge JD. Susceptibility test methods: dilution and disk diffusion methods. Manual of clinical microbiology. 11th ed. New York: American Society of Microbiology; 2015. P. 1253-73.
12. Su HC, Ying GG, Tao R, Zhang RQ, Fogarty LR, Kolpin DW. Occurrence of antibiotic resistance and characterization of resistance genes and integrons in Enterobacteriaceae isolated from integrated fish farms in south China. J Environ Monit 2011; 13:3229-36.
13. Berlau J, Aucken H, Houang E, Pitt TL. Isolation of Acinetobacter spp including A. baumannii from vegetables: implications for hospital-acquired infections. J Hosp Infect 1999; 42:201-4.
14. Durante-Mangoni E, Zarrilli R. Global spread of drug-resistant Acinetobacter baumannii: molecular epidemiology and management of antimicrobial resistance. Future Microbiol 2011; 6:407-22.
15. Choi CH, Lee EY, Lee YC, Park TI, Kim HJ, Hyun SH, et al. Outer membrane protein 38 of Acinetobacter baumannii localizes to the mitochondria and induces apoptosis of epithelial cells. Cell Microbiol 2005; 7:1127-38.
16. Dormanesh B, Mirnejad R, Khodaverdi Dariyan E, Momtaz H, Yahaghi E, Safarpour Dehkordi F, et al. Characterization and study the antibiotic resistance of Uropathogenic Escherichia coli isolated from pediatrics with pyelonephritis and cystitis in Iran. Iran J Med Microbiol 2013; 7:27-39 (Persian).
17. Potron A, Poirel L, Nordmann P. Emerging broad-spectrum resistance in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii: mechanisms and epidemiology. Int J Antimicrob Agents 2015; 45:568-85.
medical journal of mashhad university of medical sciences
Volume 60, Issue 6
May and June 2018
Pages 734-742

Files

Share

How to cite

Statistics