Document Type : Research Paper
Authors
1 Associate Professor of Infectious Diseases and Tropical Medicine, Infectious Diseases and Tropical Medicine Research Center, Zahedan University of Medical Sciences, Zahedan, Iran
2 Assistant Professor of Infectious Diseases and Tropical Medicine, Infectious Diseases and Tropical Medicine Research Center, Zahedan University of Medical Sciences, Zahedan, Iran
3 Msc, Zahedan University of Medical Sciences, Zahedan, Iran
Abstract
Keywords
مقدمه
گونه های اسینتوباکتر، کوکوباسیل های گرم منفی، غیر تخمیری و هوازی بوده که به طور وسیعی در محیط بیمارستان پراکنده و پاتوژنهای مهم فرصت طلب و مسئول عفونت های بیمارستانی مختلفی میباشند(1). در سال های گذشته گونه های اسینتوباکتر نسبت به اکثر آنتی بیوتیک ها مقاوم گردیده انداسینتوباکترها توانایی زیادی برای توسعه سریع مقاومت آنتی بیوتیکی داشته که منجر به مقاومت چند دارویی شده است ( 3،2).
یکی از مشکلات موجود در مورد اسینتو باکتر ها ظهور سویه های با مقاومت چند دارویی است که به کلاس های مختلف آنتی بیوتیکی مانند β-lactamها ،aminoglycosideها و fluoroquinolone ها مقاومند(4). بتالاکتامازها آنزیم هایی هستند که حلقه بتالاکتام را باز کرده و آنتی بیوتیک را غیر فعال می سازند.(6و5) طبق تقسیم بندی آمبلر بتالاکتامازها بر اساس ساختار اولیه شان به4 دستهَ A)تاD ) تقسیم بندی می شوند.بتالاکتامازهای نوع A،CوD سرین بتالاکتامازبوده و نوع B، متالوبتالاکتاماز است. فراوانی انواع AوC بیشتر از دو نوع دیگر می باشد کلاس A: باعث هیدرولیز پنی سیلین‌ها و سفالوسپورین‌ها می‌‌شود.
کلاس B: متالوبتالاکتامازهای وابسته به روی (zn) می‌‌‌باشد که قادر به هیدرولیز کارباپنم‌ها بوده و در باکتری‌هایی مانند سراشیامارسسنس و سودوموناسآئروژینوزا گزارش شده‌اند. کلاس B بر اساس تفاوت آمینواسیدی که در جایگاه فعال این آنزیم‌‌ها وجود دارد به 3 زیر کلاس B3، B2،B1 تقسیم می‌‌شود
کلاسC : که از آنها می‌توان به Ampc بتالاکتامازها اشاره نمود که توانایی هیدرولیز سفالوسپورین‌ها و سفومایسینها را دارند . کلاس D: بتالاکتامازهایی با قدرت هیدرولیز فراوان مثل OXA[1] بر علیه کلوکسازین ها و اکساسیلین‌ها هستند(7).
بتالاکتامازها بر اساس طیف سوبسترا وپاسخ به مهار کننده،به گروه های عملکردی مختلفی دسته بندی می شوند (8). بتالاکتاماز وسیع الطیف یا (ESBLs)[2] شامل گروه A و دسته ای از بتالاکتامازهای Dهستند که موجب هیدرولیز سفالسپورین های نسل اول،دوم،سوم و مونوباکتام شده اما توسط مهارکننده های بتالاکتامازها از جمله کلاولانیک اسید مهار و از پلاسمید های کد کننده خانواده SHV،TEM وOXA منشا می گیرند(10،9). تا به امروز بیش از 150 نوع ESBLs متفاوت شناسایی شده است (11).ESBL های تیپ OXA-2وOXA-10 جزو گروه D امبلر طبقه بندی می شوند(12).
آنزیم های OXA دسته ای از آنزیم های بتالاکتاماز هستند که آنتی بیوتیک های خانواده اگزاسیلین را هیدرولیز می کنند. اخیرا این آنزیم ها به فراوانی در بین سویه های مختلف باکتری اسینتوباکتر انتشار یافته اند. این آنزیم ها همچنین توانایی هیدرولیز آنتی بیوتیک های خانواده کارباپنم را نیز دارند. با توجه به اینکه این آنتی بیوتیک ها از جمله آنتی بیوتیک های کارامد برای درمان عفونت های حاصل از این عفونت ها می باشند لذا مقاومت نسبت به این آنتی بیوتیک ها خطری بزرگ محسوب می شود (13).
با توجه به اهمیت اسینتو باکتر در ایجاد عفونت های بیمارستانی و اهمیت بتالاکتامازها در ایجاد مقاومت به آنتی بیوتیک های بتالاکتامی وبا توجه به اینکه تا کنون مطالعه ای در این زمینه در شهرستان زاهدان صورت نگرفته بود، هدف از این مطالعه استفاده از آزمون PCRفراوانی ژن های OXA-2 وOXA-10 را در سویه های اسینتوباکتر جدا شده از بیماران در شهر زاهدان است.
روش کار
در این مطالعه مقطعی توصیفی در مجموع 100 نمونه از نمونه های بالینی مختلف که طی دی ماه 91 تا تیر ماه 92 از بیماران مراجعه کننده به بیمارستان های خاتم الانبیاء (ص)، علی بن ابیطالب (ع) و بوعلی شهر زاهدان جمع آوری شدند. از این بین 100 نمونه، 45 نمونه (45%) از بیماران بیمارستان خاتم الانبیاء (ص)، 53 نمونه (53%) از بیماران بیمارستان علی ابن ابیطالب (ع) و 2 نمونه (2%) از بیماران بیمارستان بوعلی جداسازی شد.معیار خروج افراد از مطالعه عدم مثبت شدن کشت باکتریایی آن است.
نمونه های بالینی پس از انتقال به آزمایشگاه بر محیط مک کانکی و بلاد آگار کشت داده شد و پلیت ها در حرارت 37 درجه سانتیگراد به مدت 48-24 ساعت انکوبه شدند. در صورت مشاهده رشد، پس از رنگ آمیزی و مشاهده کوکوباسیل گرم منفی با تست اکسیداز بررسی شدند. در مرحله بعد نمونه های اکسیداز منفی با استفاده از تست های بیوشیمیایی مانند حرکت، تست سیترات و کشت بر روی محیط OF حاوی قندگلوکز و رشد در دمای 42-44 درجه سانتیگراد بررسی شده و تعیین هویت قطعی انجام شد.
جهت انجام تست آنتی‌بیوگرام ابتدا سوسپانسیون باکتریایی معادل غلظت نیم مک‌فارلند تهیه شد. به این صورت که چندکلنی خالص آسینتوباکتررا در لولههای 2 میلی لیتر سرم فیزیولوژی استریل تلقیح کرده، سپس لولهها در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد قرار داده شدند تا به کدورت مورد نظر برسند (کدورت معادل نیم مک فارلند). در مرحله بعد به کمک سواپ پنبه‌ای استریل بر روی محیط مولر‌هینتون‌آگار کشت داده و پس از گذشت چند دقیقه ، دیسکهای آنتیبیوتیکی بر آن قرار گرفتند و در دمای 35-37 درجه سانتیگراد به مدت 18-24 ساعت انکوبه گردید. قطر هاله عدم رشد با خط کش اندازه‌گیری و تفسیر آن با توجه به استانداردهای(CLSI) [3] انجام گرفت و بر حسب قطر هاله عدم رشد، ایزوله‌ها به 3 گروه حساس، حد متوسط و مقاوم تقسیم‌بندی شدند.
حساسیت سویه های میکروبی به روش کربی باوئر[4] بااستفاده از دیسک های سیپروفلوکساسین5µg) )، سفتازیدیم (30µg)، سفتریاکسون (30µg)، سفوتاکسیم (30µg)، جنتامایسین (10µg)، آمپی سلین(10µg)،کولیستین(110µg)، سفکسیم(5 µg)، ایمی پنم(10µg)، اگزا سیلین (1 µg)، آزترونام ((30µg مورد سنجش قرار گرفت (14). در هر یک از سنجش های حساسیت از اسینتوباکتر ATCC 19606 به عنوان کنترل کیفی تهیه و استفاده شد(14). مقاومت همزمان به حداقل 3 کلاس آنتی بیوتیکی به عنوان MDR در نظر گرفته شد(15). جدایه ها توسط تست تاییدی تولید ESBL به روش دیسک ترکیبی (Combination Disk) با استفاده از دیسک های سفتازیدیم (30µg) و سفتازیدیم (30µg) /کلاولانیک اسید(10µg)، سفوتاکسیم (30µg) و سفوتاکسیم (30µg) /کلاولانیک اسید (10µg) مورد بررسی قرار گرفتند. نتایج طبق توصیه CLSI تفسیر گردید بدین صورت که اگر قطر هاله ممانعت از رشد دیسک ترکیبی معادل A≥5mm در مقایسه با قطر هاله ممانعت از رشد دیسک به تنهایی باشد ESBL مثبت در نظر گرفته شد(15).
جهت استخراج DNAباکتری از روش جوشاندن (Boiling) استفاده شد .به این منظور چندین کلنی خالص باکتری در ml 5 محیط کشت ( Tryptone Soya Broth) TSB تلقیح و به مدت 20 ساعت در انکوباتور شیکر دار 37 درجه سانتی گراد قرار گرفت بعد از آن 1.5ml از محیط TSB در لوله های اپندورف ریخته شد و با دور 1800×gبه مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شد مایع رویی کاملا تخلیه و رسوب با حدود 5/0 سی سی آب مقطر دیونیزه به خوبی ورتکس گردید محلول حاصل حدود 10 دقیقه در بن ماری جوش قرار گرفت در پایان 10 دقیقه در دور 1800×g سانتریفیوژ شد .محلول رویی به میکروتیوب منتقل و درب آن را بسته و تا زمان استفاده برای انجام PCR در فریزر -20ºC نگهداری نمودیم.
برای انجام PCR در این مطالعه از PCR PreMix ساخت شرکت BIONEER کره جنوبی استفاده شد. این میکروتیوب ها برای انجام PCR در حجم 20µl طراحی شده اند و حاوی مواد لازم برای انجام PCR به استثنای پرایمر، DNA الگو و آب مقطر به صورت لیوفیلیزه می باشند. برای انجام PCR، آب دوبار تقطیر شده، 1 µl پرایمر و DNA الگو را به میکروتیوپ‌های PreMix اضافه شد. توالی پرایمرهای مورد نیاز برای شناسایی ژن های OXA به شرکت تکاپوزیست ( BIONEER کره جنوبی) جهت سنتز سفارش داده شده و پرایمر ها خریداری شد. توالی و اطلاعات مربوط به پرایمرهای مورد استفاده در جدول 1 نشان داده شده است.
برنامه ترموسایکلر برای تکثیر ژن OXA-10 شامل: دناتوراسیون اولیه 94 درجه سانتیگراد به مدت 4 دقیقه، سیکل اصلی با 38 بار
تکرار شامل: دناتوراسیون در 94 درجه سانتیگراد به مدت یک دقیقه ،اتصال پرایمرها 55درجه به مدت 1 دقیقه ،تکثیر 72 درجه سانتیگراد به مدت 1 دقیقه و تکثیر نهایی 72 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه بود (16). برنامه PCR برای ژنOXA-2 مشابه برنامه فوق بوده با این تفاوت که اتصال پرایمرها برای OXA-2 در 60 درجه سانتیگراد به مدت 1 دقیقه و تکثیر در 72 درجه سانتیگراد به مدت 45 ثانیه بود(17). در نهایت به منظور الکتروفورز محصولات PCR از ژل آگاروز 2% ساخت شرکت MERCK آلماناستفاده شد. پس از جمع آوری داده ها، نتایج حاصل در نرم افزارSPSS وارد شد و یافته ها در قالب جداول آماری ارائه شد.
نتایج
از بین این 100 نمونه، از بیماران بیمارستان خاتم الانبیاء (ص) 45 نمونه (45%) ، از بیماران بیمارستان علی ابن ابیطالب (ع) 53 نمونه (53%) و 2 نمونه از سایر بیمارستان ها جداسازی شد . 46 نمونه از ETT (لوله تراشه) ، 35 نمونه از کشت خون، 10 نمونه از کشت ادرار و 9 نمونه از سایر قسمت ها و بیشتر نمونه ها از بخش ICU 83 نمونه و 17 نمونه از دیگر بخش ها جدا گردید.
حساسیت سویه های میکروبی به روش کربی باوئر بر اساس معیار منتشر شده در موسسه استانداردهای آزمایشگاهی وبالینی (CLSI) به روش انتشار در دیسک مورد سنجش قرار گرفت و نتایج آزمون دیسک آگار دیفیوژن در جدول 2 نمایش داده شده است.
توزیع فراوانی سویه های اسینتوباکتر مولد ESBLs به تفکیک بیمارستان های مورد مطالعه و بخش های بیمارستانی مشخص شد.24% نمونه ها ESBLs مثبت بودند که از45 نمونه بیمارستان خاتم (ص) یک نمونه ESBLs مثبت بود (2/2%) و از 53 نمونه بیمارستان علی ابن ابیطالب (ع) 21 نمونه ESBLs مثبت بود
39.6%) و از سایر بیمارستانها 2 نمونه گرفته شده بود که هر دو ESBLs مثبت بودند (100%) . 76 % نمونه هاMDR که 42 نمونه از بیمارستانخاتم الانبیاء (ص) و 34 نمونه از بیمارستان علی ابنابیطالب (ع) بودند.
نتایج حاصل از آزمون PCR برای یافتن ژن OXA-2 در بین سویه های مولد ESBLs نشان داد که این ژن در 5 سویه وجود داشت و 19 سویه هم فاقد این ژن بودند. شکل 1 تصویر الگوی الکتروفورزی محصولات PCR ژن OXA-2 را نشان می دهد. نمونه N فاقد DNA ، نمونه M مارکر و نمونه های 1 و 2 و 3 و 4 نمونه های مثبت از نظر وجود ژن OXA-2 می باشند.
الکتروفورز محصولات PCR ژن OXA-10 نشان داد که 4سویه از بین 24 سویه مولد ESBLs حامل این ژن بودند.و2 سویه حامل هر دو ژن OXA-2 وOXA-10 بودند. شکل 2 تصویر الگوی الکتروفورزی محصولات PCR ژن OXA-10 را نشان می دهد.
64 % نمونه ها به تمام آنتی بیوتیک ها بجز کلستین مقاوم بودند و 12% آنها به کولستین و جنتامایسین حساس و به بقیه آنتی بیوتیک ها مقاوم بودند و 95 % آنها در بخش ICU و 5 % آنها از دیگر بخش های بیمارستانی جداسازی شدند.
بحث
اسینتوباکتر یک باکتری فرصت طلب است که در افراد با نقص ایمنی بستری در محیط های بیمارستانی بخصوص در بخشهای
مراقبت ویژه( ICU)، سوختگی وجراحی عفونتهای شدید ایجاد می کند(4). از جمله آنتی بیوتیک های مورد استفاده در درمان عفو نت های ناشی از این باکتری ، آنتی بیوتیک های خانواده بتالاکتام است که مطالعات انجام شده در سال های اخیر نشان دهنده ایجاد مقاومت نسبت به این آنتی بیوتیکها است. مکانیسم های مختلفی در ایجاد این مقاومت نقش دارند که مهم ترین آنها تولید آنزیم های بتالاکتاماز بخصوص بتالاکتامازهای وسیع الطیف (ESBLs) توسط این باکتری است(18). نتایج ما نشان داد که 24 % از سویه های آسینتوباکتر جدا شده از بیماران شهر زاهدان اعم از بستری و سرپایی مولد بتالاکتاماز های وسیع الطیف بودند و تمام ایزوله ها نسبت به آنتی بیوتیک های آمپی سیلین و اگزاسیلین مقاوم بوده اند (100 % مقاوم) و بنابراین، این آنتی بیوتیک ها گزینه مناسبی برای درمان عفونت های حاصل از این باکتری نمی باشند.ومقاومت نسبت به آنتی بیوتیکهای سفو تاکسیم (99%) ، سفکسیم (99%) ، سفتریاکسون (97%) ، سفتازیدیم (83%) ، سیپروفلوکساسین (77%) ، ایمی پنم (77%)، آزترونام (74%) و جنتامایسین (70%) بود. ایزوله های اسینتوباکتر کمترین مقاومت آنتی بیوتیکی را نسبت به آنتی بیوتیک کولیستین (7%) داشته اند؛ که این امر نشان دهنده ارزش بالای این آنتی بیوتیک در درمان عفونت های حاصل از باکتری های گرم منفی می باشد هر چند امروزه در برخی نقاط دنیا مقاومت به این آنتی بیوتیک شایع شده است. 76% ایزوله ها MDR بودند که 64% آنها به تمام آنتی بیوتیکها بجز کلیستین مقاوم بودند و12% آنها به کلیستین وجنتامایسین حساس و به بقیه آنتی بیوتیک ها مقاوم بودند . الگوی مقاومت آنتی بیوتیکی ایزوله ها همچنین نشان داد که این یافته ها با مطالعات قبلی تا حد زیادی سازگاری دارد. درمطالعه ی هوچر[5] و همکاران در سال 2006 انجام دادند 89% ایزوله ها MDR بوده که 90% آنها به سیپروفلوکساسین مقاوم بودند (22) .در مطالعه داش[6] در سال 2013 در بیمارستان های آموزشی هند 137 سویه اسینتوباکتر بومانی را مورد بررسی قرار دادند که 74% MDR و همه ایزوله ها 100% حساس به کلستین بودند (23).و در این مطالعه 76% MDR و 93% ایزوله ها حساس به کلستین بودند .طی مطالعه ای که سینهان[7] و همکارانش در سال 2013 بر روی 140 سویه اسینتوباکتر بومانی جدا شده از ICU در هند انجام دادند 87% از سویه ها MDR بودند (24) .چاری[8] و همکاران در سال 2013 در تونس سویه های اسینتوباکتر از لحاظ مقاومت به ایمی پنم و کلیستین مورد بررسی قرار دادند که 14.2% از ایزوله ها به ایمی پنم و 100% به کلستین حساس بودند (25). گلبداک[9] و همکاران در سال 2014 بر روی 75 سویه اسینتو باکتر بومانی در ترکیه مقاومت آنتی بیوتیکی نسبت به آنتی بیوتیک های سفتازیدیم 89% ایمی پنم 97%، جنتاماسین 66% سیپروفلوکساسین 97.3% گزارش کردند(26).و در مطالعه ما به ترتیب 83% ، 77% ، 70% و 77% می باشد . همچنین در بررسی شاهچراغچی و همکارانش بیشتر سویه ها به سفتریاکسون، سفوتاکسیم، سفتازیدیم و سفکسیم مقاومت بالایی داشتند ولی 8/95% سویه به کلسیتین حساس بودند (27). در مطالعه ی رحیم زاده و همکاران در تبریز 77% سویه ها به کلیستین حساس بودند(28). در این مطالعه 7% سویه ها به کلسیتین مقاوم بوده که با مطالعات قبلی در ایران همخوانی دارد. و در مطالعه رحیم زاده مقاومت به ایمی پنم بیش از 62% بود(28) در حالیکه در مطالعه ما مقاومت به ایمی پنم 77% گزارش شده است که نشانگر افزایش مقاومت آنتی بیوتیکی نسبت به مطالعات قبلی می باشد که این امر می تواند به دلیل مصرف بی رویه آنتی بیوتیک ها باشد. در مطالعه ی مجتبی ساده و همکاران درسال 1392در بخشهای ویژه بیمارستان‌های منتخب تهران انجام گرفت . از 588 نمونه جمع آوری شده، 131 (3/22) گونه اسینتوباکتربومانی MDR با ترتیب فراوانی ژن‌های blaCTX (4/19%) و blaTEM (2/3%) مشاهده گردید(30). در مطالعه ی عباس نظری مقدم و همکاران که به بررسی فراوانی ژن‌های بتالاکتاماز PER و VEB در اسینتوباکتر بومانی ایزوله شده از بیماران شهر تهران در سال 1393 پرداختند نتایج آنتی بیوگرام نشان داد که بیشترین مقاومت به ترتیب مربوط به پادزیست های آمیکاسین و سفی پیم و کمترین مقاومت مربوط به پادزیست پلی میکسین B بود. میزان مقاومت چند دارویی در این سویه ها حدود 70% بود (31).
در مطالعه پیت[10] در هند میزان مقاومت به آنتیبیوتیکهای سفتازیدیم، جنتامایسین، به ترتیب 1/74%،12/70%، گزارش شده است(15). در حالیکه در مطالعه حاضر مقاومت 83% ،70% می باشد. در مطالعه ای که توسط اکان[11] بر 277 ایزوله اسینتوباکتر بومانی در بیمارستان ابن سینای آنکارا در ترکیه انجام شد، میزان مقاومت نسبت به ایمی پنم 6/56%، سیپروفلوکساسین 74% ، جنتامایسین 78% گزارش شده است (14) این درصدها در مطالعه ما به ترتیب 77، 77 و 70 بودند. نتایج مطالعه حاضر نشان داد که تولید ESBL از لحاظ فنوتیپی در 24% ایزوله های مورد بررسی مثبت بود این یافته نشانگر انتشار مقاومت از نوع ESBL در سویه های اسینتوباکتر مورد بررسی می باشد. بررسی ما با PCR نشان داد از میان 24 ایزوله ESBL مثبت ، ژن OXA-2 در 5 مورد (20.8)و ژن OXA-10 در 4 مورد (66/16%) مثبت ایزوله ها بودند. بر اساس مطالعه رحیم زاده و همکاران از میان 60 ایزوله ESBL مثبت ژن OXA-2 در 7 مورد (8/11%) و ژن OXA-10 در 5 مورد (3/8%) مثبت بودند(28). بتالاکتامازهای تیپ OXA که به اگزاسیلیناز نیز مشهور هستند گروهی از ESBL ها هستند که باکتری را به آمپی سیلین و سفالوتین مقاوم می کنند و با فعالیت هیدرولیکی بالا در مقابل اگساسیلین و کلوگساسیلین تمایز می یابند(19و20). تا کنون 142تیپ از این نوع آنزیم ها گزارش شده است(20). اکثر یافته ها در زمینه ESBL های تیپ OXA از نمونه سودوموناس آئروجینوزای جداسازی شده از کشورهای ترکیه و فرانسه به دست آمده است که از این یافته ها می توان یه 12 نوع ESBL که از منشا OXA-10 یا OXA-2 توسط جانشینی آمینواسیدی مشتق شده است، اشاره کرد(29). ولی متاسفانه بررسی های زیادی در مورد شیوع ژن OXA-2 و OXA-10 در اسینتوباکتر وجود ندارد. این باکتری به عنوان یکی از عوامل بروز عفونت های بیمارستانی با پتانسیل ایجاد مقاومت نسبت به بسیاری از آنتی بیوتیکها مطرح می باشد. با توجه به اینکه ژن های مقاومت مثل OXA-2 و OXA-10 بر روی عناصر ژنتیکی متحرک مثل اینتگرون ها قرار دارند می توانند از یک سویه به سویه دیگر منتقل شوند(28) لذا شناسایی این نوع از ژن های مقاومت آنتی بیوتیکی از اهمیت بالایی برخوردار بوده و شناسایی و تعیین شیوع این ژن ها جهت اجرای برنامه های کنترل عفونت و ممانعت از انتشار سویه های مقاوم ضروری می باشد.
)