Document Type : Research Paper
Authors
1 Department of Molecular and Cellular Sciences, Faculty of Advanced Sciences & Technology, Pharmaceutical Sciences Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran (IAUPS)
2 Department of Chemical Engineering, Faculty of Engineering, central Tehran Branch Islamic Azad University, Tehran, Iran
Abstract
Keywords
مقدمه
ناباروری به ناتوانی زوجین در باروری پس از.گذشت یک سال از مقاربت‌های منظم و بدون استفاده از روش‌های پیش‌گیری از بارداری گفته می‌شود(1،2). از دلایل عمده ناباروری می‌توان به ناهنجاری‌های ژنتیکی و عوامل محیطی واختلال در عملکرد هورمونهای جنسی اشاره کرد(3،4). استروژن یکـی از هورمـونهای جنـسی می باشد که اختلال در ژن کد کننده گیرنده آن می توانند باعث ناباروری گردد. گیرنده استروژن بتا (ER-B) یکی از ایزوفرم‌های گیرنده استروژن است. که توسط ژن ESR2 (گیرنده استروژن 2) کد می‌شود(5-7). این ژن روی بازوی بلند کروموزوم 14 واقع شده و 8 اگزون دارد(8-10). عملکرد هورمون استروژن از طریق اتصال به گیرنده خود می باشد در نتیجه هر گونه تغییر در ژن کد کننده گیرنده بتا می تواند باعث عدم عملکرد هورمون استروژن و در نهایت منجر به ناباروری شود(11-13). اهمیت این بررسی و توجه ما به پلی‌مورفیسم ژن رسپتور استروژن بتااز یک سو معطوف به نقش مهم آن درایجاد بیماریهای زنان در ایران، و همچنین عدم وجود مطالعاتی همانند تحقیق حاضر در خصوص ارتباط پلی‌مورفیسم ژن استروژن رسپتور بتا با ناباروری زنان درکشور ضرورت انجام این تحقیق را افزون کرده‌است. لذا هدف ازتحقیق حاضر بررسی ارتباط پلی‌مورفیسم ژن استروژن رسپتور بتا با ناباروری در زنان ایرانی است.
روش کار
در این مطالعه مورد- شاهدی، 130 خانم ایرانی شامل 50 خانم نابارور که فاقد فرزند بوده و پس از.گذشت یک سال از مقاربت‌های منظم و بدون استفاده از روش‌های پیش‌گیری قادر به باروری نبودند و 80 خانم به عنوان کنترل سالم با حداقل سابقه یک فرزند که نمونه های خون آنها در سال 1394 در آزمایشگاههای تشخیص طبی در شهر تهران که کاملا مجهز به تکنیک ملکولی بودند، مورد بررسی قرار گرفت. همچنین سطح هورمون محرک فولیکول ([1]FSH) بیماران توسط chemiluminescent اندازه گیری شد. مبنای اندازه گیری هورمون محرک فولیکول به دلیل این است که این هورمون ضروری برای فعالیت طبیعی گنادهاست و برای صحت عملکرد گنادها اندازه گیری این هورمون انجام گرفت. پس از دادن آگاهی و کسب رضایت نامه، 4 میلی لیتر خون محیطی از افراد مورد مطالعه در لوله های حاوی EDTA گرفته شد. استخراج DNA با روش نمک زدن صورت گرفت. DNAی استخراج شده تا زمان تحلیل در دمای 20- درجه سانتی گراد نگهداری شد (14،15).
تعیین ژنوتیپ ERB
پلی‌مورفیسم (1082 G>A) درژن گیرنده استروژن بتا به وسیله واکنش زنجیره پلیمراز(PCR[2])و هضم آنزیم محدودگر 1256049rs= Rsa1 مشخص شد. واکنش زنجیره پلیمرازدر حجم 25 میکرولیتر حاوی 5/12 میکرولیتر مخلوط واکنش زنجیره پلیمراز Master mix PCR))، 2 میکرولیتر از هر پرایمر پیشرو و پیرو و 2 میکرولیتر از DNA الگو صورت گرفت. تکثیر در 30 سیکل و تحت دماهای 94 درجه سانتی‌گراد به مدت 1 دقیقه، 64 درجه سانتی‌گراد به مدت 1 دقیقه و 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 1 دقیقه انجام شد. دناتوراسیون اولیه به مدت 5 دقیقه در دمای 94 درجه سانتی‌گراد و طویل سازی نهایی به مدت 5 دقیقه در دمای 72 درجه سانتی‌گراد صورت گرفت. محصولات واکنش زنجیره پلیمراز به وسیله آنزیم محدود کننده Rsa1 در دمای 37 درجه هضم شدند و سپس به وسیله الکتروفورز روی ژل اگارز 2% جدا شدند (جدول 1 توالی پرایمر نشان داده شده است)(16). تجزیه و تحلیل آماری با استفاده از نرم افزار SPSS انجام شد جهت تعیین معنی دار بودن ژنوتیپ ها در 2 گروه بیمار و سالم از آزمون کای مربع استفاده شد در این ازمون 05/0 P< نشان دهنده معنی دار بودن تفاوت ژنوتیپی بین گروهها در نظر گرفته شد.
نتایج
در این مطالعه 130 نفر شامل 50 نفر زن مبتلا به ناباروری و
80 زن سالم به عنوان کنترل بررسی شدند. جهت تعیین پلی‌مورفیسم از روش پلی مورفیسم قطعات طولی محدود (RFLP[3]) استفاده گردید و سپس نتایج به‌دست آمده با ژل آگارز 2% بررسی شد.
بررسی پلی‌مورفیسم G>A ESRB انحراف از تعادل هاردی –واینبرگ را برای هر دو گروه بیمار 32/28 x2=و
001/0 P<گروه سالم 59/11x2= و02/0 P=را نشان داد. بر طبق نتایج حاصل از این مطالعه، تفاوت معناداری در فراوانی الل A و الل G 5/0 P=بین دو گروه زنان نابارور و گروه زنان سالم یافت نشد. افراد نابارور با فراوانی ژنوتیپ AA و GG ارتباط معناداری با بیماری ناباروری نشان ندادند (8/0P=). اما بیمارانی با ژنوتیپ هتروزیگوت AG افزایش معناداری با بیماری نشان دادند (001/0P=).و این درحالی است که افراد نابارور با ژنوتیپ AG، با افراد سالم با ژنوتیپ هموزیگوت AA و هموزیگوت GG مقایسه شده بودند و همچنین ارتباطی بین سن بیماران و سطح سرمی هورمون محرک فولیکول مشاهده نشد.
بحث
در مطالعه حاضر ارتباط پلی‌مورفیسم ژن ESRB با ناباروری در زنان ایرانی مورد بررسی قرار گرفت. بر طبق نتایج حاصل از این مطالعه، بین فراوانی ژنوتیپی AG، با ناباروری زنان ارتباط معناداری وجود دارد(001/0P=). و افراد با ژنوتیپ AG احتمال بیشتری برای ابتلا به ناباروری دارند. امروزه مطالعه مباحث ملکولی گیرنده‌های استروئیدی به عنوان یکی از مباحث مهم مطرح است(17-19). در این مطالعه پلی‌مورفیسم در ژن ESR2 و ارتباط آن با ناباروری زنان مورد مطالعه قرار گرفت. این ژن روی بازوی بلند کروموزوم 14 قرار دارد.و حاوی 8 اگزون است(20،21).
محصول این ژن ایزوفرم B از ایزوفرم‌های معروف گیرنده‌های استروژن است. (22-24). در مطالعه‌ای لیاکات[4] وهمکاران درسال 2015 بر روی 74 زن نابارور و 50 زن سالم در کشور پاکستان آنالیزهای ملکولی برای شناسایی پلی‌مورفیسم در ژن ESR2برای هر دو گروه انجام شد. اما هیچ پلی‌مورفیسمی شناسایی نشد. تمام افراد مورد مطالعه برای الل GG هموزیگوت بودند. که این نشاندهنده عدم وجود پلی‌مورفیسم در جمعیت مورد مطالعه بود(25). در مطالعه حاضر ارتباط بین سن و سطح سرمی هورمون محرک فولیکول بیماران و افراد سالم محاسبه شد.اما هیچ ارتباطی بین سن بیماران و سطح اندوکرین آنها یافت نشد.که می توان بیان کرد که سطح گنادوتروپین‌ها رابطه مستقیمی با ناباروری ندارند. تاکنون هیچ مطالعه‌ای در مورد رابطه بین پلی‌مورفیسم ژن ESR2 در زنان ایرانی نابارور انجام نشده است. لذا دراین مطالعه برای نخستین بار به بررسی تاثیر پلی‌مورفیسم ژن ESR2 در ناباروری زنان ایرانی پرداخته شده است با توجه به نتایج حاصل از این مطالعه که برروی 50 زن نابارور و 80 زن سالم به عنوان کنترل صورت گرفت، می‌توان گفت به احتمال زیاد ژنوتیپ‌های AG پلی‌مورفیسم ژن ESR2 می‌تواند در استعداد ابتلای به ناباروری در زنان موثر باشد. ناباروری یک بیماری مولتی فاکتوریال می باشد از این رو لازم است که نقش سایر عوامل ژنتیکی در بروز ناباروری بررسی شود.
نتیجه گیری
نتایج این پژوهش حاکی از ارتباط پلی‌مورفیسم ESR2 با ناباروری زنان می‌باشد.(001/0P=) وافراد دارای ژنوتیپ AG احتمالا بیشتر به ناباروری مبتلا می‌شوند.
)