Frequency of erm A, B, C genes in Erythromycin resistant Enterococci isolated from Clinical samples of inpatients of Teaching Hospitals in Qazvin & Tehran

Document Type : Research Paper

Authors

1 Assistant Professor in Qazvin University of Medical Sciences/Cellular & Molecular Research Centre & Department of Microbiology , Qazvin, Iran

2 Assistant Professor in Qazvin University of Medical/ Department of Microbiology, Qazvin University of Medical Sciences, Qazvin, Iran

3 MSc. In Microbiology / Qazvin University of Medical Sciences, Cellular & Molecular Research Centre & Department of Microbiology , Qazvin, Iran

4 Professor in Microbiology/ Cellular & Molecular Research Centre & Department of Microbiology, Qazvin University of Medical Sciences, Qazvin, Iran

Abstract

Introduction: Enterococci are among the most important causes of urinary tract infections. The aim of this study was to assess the frequency of erm A, B, and C genes in erythromycin-resistant Enterococci isolated from the clinical samples of inpatients of university teaching hospitals in Qazvin and Tehran.
Materials and Methods: From 2012 to 2013, a total of 165 samples of enterococci were isolated from the clinical samples of inpatients. Susceptibility to erythromycin in enterococci isolates was performed by agar dilution and disk diffusion methods according to the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) guideline.  Erythromycin resistance genes (ermA, B, and C) were identified by PCR.
 Results: Out of 165 clinical isolates of enterococci, 142 (86%) isolates were Enterococcus faecalis and 23 (13.9%) isolates Enterococcus faecium. The results of susceptibility test showed that 158 (% 95) isolates were resistant or with intermediate sensitivity to erythromycin. There was a good correlation between the results of disk diffusion and agar dilution methods.  Of total samples, 147 (89%) isolates were resistant to erythromycin (MIC≥8 µg/ml), 11 (6.6%) isolates with intermediate sensitivity (MIC 1-4 µg/ml), and 7 (4.2%) isolates with complete sensitivity to erythromycin (MIC ≤ 0.5 µg/ml).
 Conclusion: The results of this study showed high prevalence of ermA, B, and C genes in erythromycin-resistant strains with ermB asthe most common resistance gene among these isolates.

Keywords


مقدمه: انتروکوک ها از جمله شایع ترین عوامل عفونت بیمارستانی، به ویژه در بخش های مراقبت ویژه ( ICU ) هستند. عفونت ناشی از این باکتری هنگام تجویز سفالوسپورین ها و دیگر آنتی بیوتیک هایی که انتروکوک ها نسبت به آنها مقاومند ایجاد می شود. انتروکوک ها عمدتا از یک بیمار به بیمار دیگر از طریق دست کارکنان بیمارستان که برخی از آنها نیز ناقل هستند منتقل می شوند. حدود 12 گونه انتروکوک وجود دارد. انتروکوکوس فکالیس (E. faecalis) شایع ترین گونه بوده و عامل 85-90 % عفونت های انتروکوکی است و انتروکوکوس فسیوم ( E. faccium ) عامل 5-10 % عفونت ها می باشد (1). در ایالات متحدهتخمین زده می شود که سالانه 800000 عفونت انتروکوکی رخ میدهد که هزینه درمان برای هر مورد حدود 500 دلارمی باشد (2). در این گروه از باکتری ها مقاومت به طیف وسیعی از آنتی بیوتیک ها مشاهده می گردد از جمله این مقاومت ها می توان به مقاومت ذاتی به ماکرولید ها،کلرامفنیکل، پنیسیلین،تتراسایکلین وآمینوگلیکوزیدها اشاره کرد. مقاومت چندگانه (1MDR) یکی از خصوصیات انتروکوک ها می باشد (3-6).  ماکرولیدها محصولمتابولیسمثانویهبسیاریازگونههای اکتینومیست هاهستند. اریترومایسین،آنتیبیوتیکشاخص اینگروهمیباشدکهازیکحلقهلاکتونمتصلبهدو قنددیسوسامین2  وکلادینوز3  تشکیلشدهاست. ماکرولیدهایدیگراز اریترومایسینمشتقشدهاندوشاملکلاریترومایسین، آزیترومایسین،دیریترومایسین4  و رکسیترومایسین 5  هستند (7-9). دو مکانیسم مهم در مقاومت به ماکرولید ها وجود دارد که مهمترینآن تغییر جایگاه هدف که به واسطه ژن های 6erm کد شده و مقاومت به ماکرولید ها ولینکوزآمیدها، استرپتوگرامین B (MLSB) را سبب می شود و یک سیستم پمپ افلاکس که در غشا واقع شده که ژن های mef(A/E) ,  msr  آن را کد می کنند و سبب خروج دارو از سلول باکتری می گردد (10). ژن های ermمسئول کد کردن متیل ترانسفرازها می باشند. این آنزیم ها سبب القاء دمیتیلاسین یک گروه آدنین  (A2058/A2059) از دومین V در جایگاه پپتیدیل ترانسفراز زیر واحدS23 ریبوزومیمی گرددکه در نهایت سبب کاهش میل ترکیبی اتصال و ایجاد مقاومت به ماکرولیدها،لینکوزآمین ها واسترپتوگرامین B(MLSB) می گردد. ژنهای  erm دربسیاریازترانسپوزونها شناساییشدهاند (11-13). پمپهاییونیاز دوازدهبخش تشکیلشدهاندکهازعرض غشایسیتوپلاسمیعبورنمودهودرایجادانرژیو نیرویمحرکهپروتونیدخالتدارند. پمپیونی mefA سوبستراهایمتعددیماننداریترومایسینومشتقاتآن مانندآزیترومایسینرادارد (15،14). در مطالعات اخیر که بر انتروکوک ها انجام شده، نشان داده که مقاومت انتروکوک ها  به اریترومایسین (ERY) بالاتر از  70% -80 % می باشد (6).اکثر ایزولههای انتروکوکی جدا شده ی مقاوم به اریترومایسین که تاکنون مطالعه شده اند دارای ژن ها ermA,B,C می باشند و فراوانی ژن  ermB بیش از همه (بالاتر از 70%) بوده و فراوانی ژن های ermA و  ermC وابسته به منطقه جغرافیایی متفاوت  می باشند. بررسی مقاومت آنتی بیوتیکی و مکانیسم های مولکولی آن از جمله مقاومت به ماکرولید ها در انتروکوک ها از اهمیت بالایی برخوردار است  . لذا دراین مطالعه به بررسی مقاومت به اریترومایسین و فراوانی ژن های ermA ، B و C در ایزوله های بالینی انتروکوک جدا شده از بیماران بستری پرداخته شده است .

روش کار:

تعداد 165 ایزوله انتروکوکی جدا شده از نمونه های بالینی بیماران بستری در دو بیمارستان آموزشی  شهر قزوین و  بیمارستان های شریعتی ، سینا و مسیح دانشوری تهران از اردیبهشت ماه 1391- خرداد ماه 1392 جمع آوری گردید.پس از آن تمامی نمونه ها به منظور ذخیره کردن در محیط  TSB+ گلیسرول 10% برده ودردمای 20- درجه سانتی گراد  فریز گردید.

تمامی نمونه ها بر اساس تست های تشخیصی رنگ آمیزی گرم ، اکسیداز ، کاتالاز ، رشد در 5/6% نمک ،آزید مالتوز آگارو بایل اسکولین تائید گردیدند.

تست های افتراقی انتروکوکوس فکالیس و انتروکوکوس فاسیوم، تست تخمیر قند و تولید پیگمان می باشد. در این بررسی از قند های سوربیتول ، آرابینوز و رافینوز استفاده شد.

در روش دیسک دیفیوژن، ابتدا از کشت 24 ساعته باکتری، سوسپانسیون معادل نیم McFarland تهیه و بر روی  محیط  Muller-Hinton آگار به روش کشت جارویی تلقیح شد، سپس دیسک اریترومایسین gµ 15 ( ساخت شرکت Mast) بر روی محیط قرار داده شد آن گاه پلیت ها در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 24 ساعت انکوبه گردید و در نهایت پلیت ها از نظر  قطر هاله مطابق استاندارد 2013 CLSIمورد بررسی و اندازه گیری قرار گرفت. برای انجام کنترل کیفی دیسک اریترومایسین  و محیط مولر هینتون آگار از سویه استاندارد  Entercoccus faecalis ATCC 29212 مطابق با استاندارد های پیشنهادی CLSI استفاده گردید .

در این مرحله حداقل غلظت مهاری اریترومایسین  (1MIC) کلیه ایزوله های انتروکوکی به روش آگار دایلوشن مورد بررسی قرار گرفت.  تعیین MIC انتروکوک هایی که در غلظت g/mlµ MIC≥8از آنتی بیوتیک اریترومایسین رشدشان مهار شد، انتروکوک مقاوم به اریترومایسین ، انتروکوک هایی در غلظت g/mlµ MIC1-4 به عنوان حد واسط و انتروکوک هایی که در غلظت g/mlµ MIC≤ 0.5از آنتی بیوتیک اریترومایسین رشد داشتند حساس در نظر گرفته شدند.

در این مطالعه برای استخراج DNA از کیت استخراج/USA) (Life Technologies استفاده شد و مراحل آن مطابق با دستورالعمل کیت انجام گرفت  .

برای شناسایی ژن های ermA,B,C از آزمایش PCR استفاده شد تا حضور ژن ها در انتروکوک های مقاوم مورد بررسی قرار گیرد. در این تحقیق از سه جفت پرایمر برای شناسایی این ژن ها استفاده شد. روش PCR با استفادهازدستگاهترموسایکلر (ABIBiosystem / USA)  باشرایط بهینه سازی شده به شکل زیر انجام گرفت. واسرشت اولیه94 درجهسانتیگرادبهمدت5دقیقه (Hot start) ودر ادامه35چرخهشامل94درجهسانتی گرادبهمدت 30 ثانیه (Denaturation)، 51 درجهسانتیگرادبهمدت 30 ثانیه (Annealing) و72درجهسانتیگرادبه مدت30 ثانیه (Extension) ودرنهایت72درجه سانتی گرادبهمدت5دقیقهانجامشد . برایاینمنظور 8 میکرولیتر Mix Red 1.5Mm Mgcl2 2XMasterTaq ، 7/0 میکرولیتر از هر پرایمر، 2 میکرولیترDNA الگو و 6/8 میکرولیتر آب مقطر اضافه شد. به منظور مشاهده محصول PCR از ژل الکتروفورز (maxpure agarose  /spain) با غلظت 1%  آماده سازی شد و نتایج با دستگاه ژل داکت / USA)  GEL LOGIC212 pro( ثبت و موردبررسیقرارگرفت. به عنوان کنترل مثبت ژن های ermA,B,C از سویه های سکانس شده جناب آقای دکتر عینی استفاده گردید (13). اطلاعات با نرم افزار SPSS تجزیه و تحلیل شد.

نتایج: با استفاده از توانایی تخمیر قند سوربیتول ، آرابینوز و رافینوز و رشد در 4 درجه تمامی نمونه ها به منظور جداسازی انتروکوکوس فکالیس و انتروکوکوس فاسیوم و تمایز آنها انجام گردید. از بین 165 ایزوله انتروکوک ، انتروکوک فکالیس142 ( 86% ) وانتروکوک فاسیوم 23 (9/13%)نمونه بوده، ایزوله های بالینی به ترتیب فراوانی، 113 (4/68%) از ادرار، 18 (9/10%) از زخم، 15 (9%) از خون، 5 (3%) از آسیت و 14 (4/8%) از نمونه های کلینیکی دیگر وجود داشت. همچنین فراوانی ایزوله ها به تفکیک بخش های بیمارستانی، بخش مراقبت های ویژه 68 (2/41%)، بخش کودکان 47 (4/28%)، بخش داخلی 50 (3/30%) بودند. طبق دستورالعمل CLSI ، نتایج به دست آمده از MIC به روش آگار دایلوشن، 7 (2/4%) ایزوله حساس به اریترومایسین (g/mlµ MIC≤ 0/5)، 11 (6/6%) ایزوله حدواسط (g/mlµ MIC 1-4 ) و 147 (89%) ایزوله مقاوم به اریترومایسین (g/mlµ MIC≥8) بودند که در نتایج دیسک دیفیوژن و آگار دایلوشن هم خوانی کامل وجود داشت.  از بین 23 ایزوله انتروکوکوس فسیوم تعداد 21 ایزوله (3/91%) مقاوم به اریترومایسین بودند که بیانگر مقاومت آنتی بیوتیکی بیشتر انتروکوکوس فسیوم نسبت به فکالیس می باشد . در 165 ایزوله انتروکوک، تعداد 18 سویه ( 9/10%) دارای MIC پایین تر از g/mlµ128˃ بودند و تعداد 147 سویه (89%) دارای MIC بالا تر از g/mlµ128˃بودند. مقادیر MIC50 و  MIC90 برای ایزوله های انتروکوکوس فکالیس و فسیوم بالاتر از g/mlµ128˃ بود. فراوانی ژن های  ermA,B,C در 158 ایزوله غیر حساس ( ایزوله های مقاوم و حد واسط ) به اریترومایسین بدین ترتیب می باشد ، 41 (9/25%) ایزوله دارای ژنermB  ، 64 (5/40%) ایزوله دارای ژن ermB,C ، 14 (8/8%) ایزوله دارای ژن ermA,Bو 39 (6/24%) ایزوله دارای ژن ermA,B,C بودند. ژن های ermA وermCبه تنهایی در هیچ کدام از ایزوله ها مشاهده نشد.در مجموع  ermBبا  95%  به عنوان فراوانترین ژن  و ژن های ermC  ( 63% ) و   ermA  (32% ) به ترتیب در رتبه های بعدی  قرار گرفتند.

بحث:انتروکوکهاگروهمهمومتنوعیازباکتریها هستند که اهمیت ویژه ای از نظر مقاومت دارویی چند گانه (MDR)  دارند. مهمترین مشکل انتروکوک ها  مقاومت نسبی و مطلق آنها در برابر آنتی بیوتیک ها است. از عوامل خطر برای انتروکوک های MDR شامل کلونیزاسیون گاستروانتستینال انتروکوک ها، سن بالا، بیماری زمینه ای شدید، سرکوب سیستم ایمنی، اقامت در ICU ، جراحی (مخصوصاً دستگاه گوارش، قلبی عروقی و پیوند)، ابزارهای داخل عروقی و در تماس بودن مداوم با آنتی بیوتیک های دیگر می باشد (16). آنتیبیوتیکهایمصرفیدرمحیطهایبیمارستانی، انتخابانتروکوکهایپاتوژنراتحتتاثیرقرارداده، به گونهایکهبرتعداد سویههایدارایمقاومتچنددارویی و بعضاً سویههایمقاومبههمهآنتیبیوتیکها افزودهمی شود. مقاومتبه ماکرولیدهادرانتروکوک ها اهمیتاپیدمیولوژیکی زیادیدرمناطقمختلفدنیاداشتهاست. درمناطقمختلفایرانوجهانبهدلیل تغییراتژنتیکیدرسویههایایجادکنندهوتفاوت درمصرفمیزانآنتی بیوتیک ها ووجوداختلافدرمیزان دسترسیبهآنتیبیوتیک هایوسیعالطیفوجدیدمتفاوت می باشد.  بااینوجودافزایشمیزان مقاومتآنتیبیوتیکیدراینباکترییکپدیدهجهانی است (17). این باکتری سومین عامل باکتریمی و دومین عامل عفونت دستگاه ادراری [1] به شمار می آید وهمچنین به دلیل عدم اطلاع کافی به مقاومت آنتی بیوتیکی به ویژه در اپیدمی انتروکوک ها بعضی از اطلاعات برای درمان مناسب عفونت های انتروکوکی مورد نیاز هستند (19،18). در این مطالعه میزان مقاومت به آنتی بیوتیک اریترومایسین بررسی شد که بیان کننده مقاومت ذاتی و بالا به ماکرولیدها در سویه های انتروکوک می باشد. از بین 165 ایزوله انتروکوک مورد بررسی، مقاومت به اریترومایسین در 147 ایزوله (89%) بوده که بیانگر مقاومت بالای انتروکوک ها به اریترومایسین است. در این مقاومت  ermB بیشترین فراوانی را داشته که158 (95%) ایزوله، ژن ermC  104 (63%) ایزوله و ژن ermA 53 (1/32%) ایزوله بودند. در مطالعه حاضر از MIC به روش آگاردایلوشن با رقت های 128-25/0 میکروگرم بر میلی لیتراستفاده شده بود که 7 (2/4%) ایزوله حساس به اریترومایسین، 11 (6/6%) ایزوله حدواسط و 147 (89%) ایزوله مقاوم به اریترومایسین بودند. MIC50 و  MIC90  برای ایزوله های انتروکوکوس فکالیس و فسیوم بالاتر از g/mlµ128˃ بود. در این مطالعه سویههایبالینی از ادرار113 (4/68%)، زخم  18 (9/10%) ، خون 15 (9%) بیشترینتعداد نمونه کلینیکی را تشکیل دادند. در مطالعه ای که در سال 2007-2009 در چین توسط زو[2] و همکارانش صورت گرفت  از 117 ایزوله انتروکوکوس فکالیس جدا شده از بیماران، 78 (6/66%) ایزوله مقاومت به اریترومایسین گزارش شد. 58 (74/3%) ایزوله دارای ermB و 37 (47/4%) ایزوله دارای ermA بودند. 17% از ایزوله ها هر دو ژن ermB و ermA و 5/2% ایزوله ها دارای ermC بودند. از بین 78 ایزوله مقاوم به اریترومایسین، 75 ایزوله با MIC≥128 µg/ml بودند که مشابه مطالعه حاضر بود (11). در مطالعه ای دیگری که توسط عینی وهمکارانش در سال 2007 بر 326 ایزوله بیمارستانی انتروکوک در بیمارستان های تهران ا نجام شد ، مقاومت به اریترومایسین 45% گزارش گردید  و  41% ایزوله های مقاوم به اریترومایسین حاوی ژن,ermB 5 % ایزوله ها حاوی ermA بوده و  ermC در هیچ ایزوله ای مشاهده نشد(13)  ermB در این مطالعه  مشابه با نتایج به دست آمده از مطالعه حاضر بیشترین فراوانی را داشته در حالیکه فراوانی  ermC با مطالعه حاضر که (63%) بوده متفاوت می باشد ، که این تفاوت می تواند به دلیل تغییرات ژنتیکی در سویه های ایجاد کننده و تفاوت درمصرف میزان آنتی بیوتیک در مناطق جغرافیایی مختلف باشد. مطالعه دیگری در اسپانیا در سال 2010 توسط لوپز[3] و همکارانش برای تشخیص مقاومت MLSB  در انتروکوک ها بر اساس حضور  ژن های متیلاز rRNA با روش PCR و تعیین حداقل غلظت مهاری نشان داد که از 148 ایزوله مورد بررسی، 94% از ایزوله ها دارای مقاومت به اریترومایسین بوده و MIC 50 , MIC 90  برای این ایزوله ها µg/ml 256تعیین گردید و2/89%  از ایزوله ها فقط دارای ژن ermB بودند.  نتایج این مطالعه نشان داد که هیچ یک از ایزوله ها دارای مقاومت به لینوزولید، تیکوپلانین نمی باشند (20).  ارستراپ[4] و همکارانش درسال 2000-1999 بر روی 98 ایزوله انتروکوکوس فکالیس و 65 ایزوله انتروکوکوس فسیوم در دانمارک مطالعه کردند. این مطالعه نشان داد که 72 سویه از انتروکوکس فکالیس ( 5/73 %)  و  همچنین( 9/96 %) از سویه های انتروکوکوس فسیوم مقاوم به اریترومایسین بودند. فراوانی ژن ermB  در انتروکوکوس فکالیس(7/84 %) و  در انتروکوکوس فسیوم( 7/61%) گزارش شده بود (21).  با توجه به اینکه انتروکوک ها در دستگاه گوارش انسان وحیوانات کلنیزه شده و باعث بیماری می شوند لذا این باکتری ها از نظر دامپزشکی و بیماری های مربوط به دام نیز حائز اهمیت می باشند. این باکتری ها با مصرف بی رویه آنتی بیوتیک ها در حیوانات مولد غذا مقاومت را کسب کرده و باعث آلودگی گوشت و فرآورده های گوشتی شده و از این طریق به دستگاه انسان راه می یابند. در سال های اخیر مطالعات مشابه زیادی در دامپزشکی بر روی مقاومت به انتروکوک ها انجام شده است. اوبنگ[5] و همکارانش در سال 2008-2009 بر ایزوله های انتروکوک  جمع آوری شده  از جوجه ها در واحدهای پرورش مرغ استرالیا به  بررسی پرداختند. از روش فنوتیپی آگاردایلوشن و روش ژنوتیپی PCR برای تشخیص ژن های مقاومت به اریترومایسین استفاده شده بود. مهمترین عامل مقاومت ژن ermB گزارش شده بود که مقاومت متقاطع با تایلوزین و لینکوزآمین ایجاد می کرد (22). مطالعه دیگر در چین توسط لیو[6]و همکارانش در سال 2009 بر 453 ایزوله انتروکوک از حیوانات مولد غذا انجام شد که مقاومت به اریترومایسین به روش آگاردایلوشن و  PCR ، 8/72% گزارش شده بود (23).

نتیجه گیری: نتایجاینمطالعه و پژوهشمقاومت بسیار بالای انتروکوک های جدا شده از نمونه های بالینی بیماران بستری را به اریترومایسن و شیوع بسیار زیاد ژن های erm به ویژه ermB را نشان می دهد. هر چند مقاومت دارویی به تنهایی توجیه کننده بیماری زایی انتروکوک ها نمی باشد وسایر خصوصیات بیماریزایی مانند توانایی اتصال،انتشار وفرار از سیستم ایمنی در کنار شاخص های مقاومت دارویی می تواند در این امر دخالت داشته باشد ولیکن باتوجهبهسهولتانتقالژنهایبیماریزاییومقاومت آنتیبیوتیکیدرمیانسویههایانتروکوکنسبت به سایرباکتری هایگرممثبت؛ شناساییسویههایمقاوم به آنتیبیوتیکدرمحیطهایکلینیکیمی تواند به عنوانیکخطر جدیتلقی گردد. همچنین نیاز به آنتی بیوتیک های جدید جهت جایگزینی آنتی بیوتیک های موثر فعلی برای درمان عفونت های ناشی از این باکتری ها د.رآینده ای نزدیک دور از انتظار نیست . استخراج الگوی  مقاومت و تعیین مکانیسم های مولکولی آن  از طرف دیگرمی تواند در تعیین رژیم درمانی مناسب برای بیماران  و ارایه نتایج آن به کمیته های کنترل عفونت بیمارستان ها از جهت  کنترل سویه های دارای  مقاومت چند گانه و همچنین از نظر بررسی های اپیدمیولوژی و نیز از جنبه اقتصادی برای کاهش هزینه درمان می تواند موثر باشد.