نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 گروه زیست شناسی، واحد مرودشت، دانشگاه آزاد اسلامی، مرودشت،فارس، ایران
2 دانشکده علوم، دانشگاه اصفهان، اصفهان، ایران
3 گروه میکروبشناسی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد، شهرکرد، ایران.
4 مرکز تحقیقات عصب شناسی اصفهان، بیمارستان الزهرا، گروه نورولوژی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: Multiple Sclerosis (MS) is a major autoimmune disease of the central nervous system. Today it is specified that changes in the sequence of single nucleotides or SNPs are associated with disease or resistance to disease. In recent studies, the association of micro-RNA polymorphism has been reported with diseases such as cancer and autoimmune diseases. Micro RNA is a group of non-coding RNA that affects a variety of biological processes such as growth, cell division, and immunity.
Materials&Methods: blood samples were collected from 71 MS patients and 71 healthy subjects, and DNA was extracted. Genotyping analysis was performed using TARMS PCR technique. The relationship between rs3745453 polymorphism and MS was evaluated by statistical tests.
Results: TT, TC and CC genotypic frequencies are 34, 24 and 13 in patients and 39, 11 and 21% in control group respectively. In both groups, the TT genotype was dominant and heterozygote frequencies were higher in patients than control group. Odd ratio (OR) in TC genotype was 2.7. In other words, heterozygote individuals have a 2.7 times higher chance of MS than others
Conclusion: This study was the first report of the relationship between mir23a polymorphism and MS disease. According to the results, we can say that mir 23a rs3745453 polymorphism is associated with Multiple sclerosis (P = 0.029). It is suggested that further studies should be done with more samples.
کلیدواژه‌ها [English]
مقدمه
مالتیپل اسکلروزیس یاMS از بیماریهای خودایمن سیستم اعصاب مرکزی (مغز و نخاع) بوده که امروزه حدود 5/2میلیون نفردر سراسر جهان به آن مبتلا هستندMS . از بیماریهای مزمن التهابی و عامل ایجاد ناتوانی فیزیکی جدی خصوصا در بین جوانان و زنان در محدوده سنی 20تا40 سال میباشد. شیوع این بیماری در زنان چندین برابر مردان گزارش شده است (1). علائم بالینی در افراد مختلف متفاوت بوده به طوری خستگی، اختلالات بینایی و حسی، درد و ناتوانی حرکتی با درجات متفاوت در افراد بیمار مشاهده میگردد. تفاوت در علایم بالینی در ارتباط با سایتهای آسیب دیده در سیستم عصبی مرکزی است که این آسیبها به علت عبور سلولهای ایمنی از سدخونی مغزی ایجاد شده و در نهایت منجر به ایجاد التهاب، دمیلینه شدن، آسیب سلول های گلیال[1]، دژنره شدن آکسونی[2] و در نتیجه اختلال در ارسال پیام عصبی میشود. ضایعات اغلب در نخاع، ساقه مغز، بافت اطراف بطنی و عصب بینایی ایجاد میشوند (2). سلولهای T در ایجاد ضایعات نقش اولیه دارند. بیماری با لنفوسیتهای خود فعال آغاز شده که پاسخهای نابجا در برابر اتوآنتی ژنهای CNS ایجاد میکنند. عبور سلولهای ایمنی از خون محیطی که در افراد MS نوع عود کننده – بهبود یابنده[3] غالب است، از تارگتهای اصلی در درمانهای در دسترس MS است.
بیماری MS، از نظر بالینی به فرمهای زیر تقسیم بندی می گردد
فرم(RR-MS)Relapsing-Rremitting عودکننده–بهبود یابنده
فرم(SP-MS) Secondary progressive پیشرونده ثانویه
فرم (PP-MS) Primary progressive پیشرونده اولیه
فرم(RR-MS) به صورت عودکننده - بهبود یابنده، در 80تا90% افراد مبتلا دیده میشود. در این فرم دورههایی از حملات متناوب و بهبودی نسبی مشاهده میگردد که با گذشت زمان و با افزایش تدریجی آسیبهای سیستم عصبی، معلولیتهای شدیدی را نیز به همراه خواهد داشت، به طوری که حدود 50% از بیماران پس از 19 سال به ویلچر نیاز خواهند داشت که منجر به ایجاد فرم دیگر این بیماری یعنی (SP-MS) یا پیشرونده ثانویه، خواهد شد.
فرم سوم PP-MS یا بیماری پیشرونده از ابتدا، حدود 10 تا20% بیماران را به خود اختصاص داده که بیماران معلولیتهای پیشرونده بدون حملات حاد را تجربه خواهند کرد (3).
علی رغم پیچیدگی و مکانیسم ناشناخته این بیماری، اعتقاد بر این است که در افراد مستعد از لحاظ ژنتیکی برای مثال ناحیه [4](HLA)، مداخله فاکتورهای محیطی و اپی ژنتیکی میتواند زمینه ساز ابتلا به MS شود. عوامل محیطی مانند زندگی در نواحی معتدل، کمبود ویتامین D، استرس و بیماریهای ویروسی از جمله ریسک فاکتورهای مشاهده شده در افراد بیمار است (4).
میکروRNA،(miRNA) RNA های کوچک غیرکدشونده تقریبا به طول 18 تا23 نوکلئوتید بوده که از طریق تخریب یا مهار ترجمهی mRNA تولید پروتئین را متوقف میکنند. امروزه نقش کلیدی این عناصر ژنتیکی در تنظیم فرایندهای سلولی مختلف مانند رشد، سیکل سلولی، تمایز، آپوپتوز، متابولیسم و رگ زایی مشخص شده است. علاوه بر این گزارش شده است که miRNA ها، در مسیر های انکوژنی یا تومور ساپرسوری در تنظیم شبکههای بیان ژنی نیز اثر گذارند. بیانmiRNAها درسلولهای ایمنی و سیستم عصبی بسیار بالا بوده که نشان دهنده اهمیت آنها در نوروایمونولوژی است. شناسایی و پایداری این عناصر در مایعات بدن، استفاده از آنها را به عنوان بیوماکر جدید در تشخیصهای کلینیکی هموار کرده است. مطالعات اخیر مشخص کرده است که تغییر تک نوکلئوتیدی در توالی miRNA میتواند تولید یا تمایل آنها برای اتصال به ژنهای هدف را تغییر دهد و باعث ایجاد تغییرات پاتولوژیک شود. فعالیت بیولوژیک سلولهای T و B cell تحت تاثیر miRNA های خاصی قرار داشته که در تنظیم، تکوین و تمایز ردههای مختلف سلولی دخالت دارند (5).
رشد و تکوین Tcell در تیموس و فعالیت آنها در خون محیطی در ارتباط با شبکه سیگنالینگ پروتئینی پیچیدهای است، که توسط miRNAها کنترل میشود. سیستم ایمنی ذاتی نقش مهمی در اتوایمنی ایفا میکند. مطالعات مشخص کرده است که تکوین سلولهای رده میلویید و عملکردشان در اثر تعامل داینامیک بین ترانس کریپشن فاکتورهای خاص وmiRNA هاست. این miRNAها در تنظیم گرانولوسیتها، منوسیتها، ماکروفاژها،CD ها ،سلول کشنده طبیعی[5] فعالیت میکنند (6).
در برخی از مطالعات بیان غیر نرمال miRNA ها در افرادMS در مقایسه با سالم مشاهده شده است (12). تغییرات و موتاسیونهای ژنتیکی در miRNA تکامل سیستم ایمنی و پاسخ ایمنی را تحت تاثیر قرار داده ودر پاتوژنز بیماریهای خود ایمنی مانند MS نقش دارند.
mir23a اولین عضو شناسایی شده در کلاستر miR-23a~27a~24-2 بوده که تاکنون نقش آن در چندین نوع سرطان، هایپرتروفی قلبی، و آتروفی ماهیچهای به اثبات رسیده است و در برخی از مطالعات مشخص شده است که بیان miR23a در بیماریهایی مانند، AML،CLL سرطان معده و سرطان کبد و سینه افزایش مییابد (5-7).
با توجه به اهمیت عملکرد میکرو RNA ها در مراحل مختلف تکوین و عملکرد سیستم ایمنی، در این مطالعه به بررسی اثر پلی مرفیسم ژنتیکی mir23a rs3745453 و ریسک ابتلا به ام اس پرداخته شده است. مطالعه حاضر برای اولین بار به بررسی ارتباط miRNA با بیماری MS میپردازد.
روش کار
این تحقیق مورد – شاهدی (case- gontrol) بر روی71 بیمار مبتلا به MS که بیماری آنها توسط متخصص مغز و اعصاب تایید شده بود و 71 فرد سالم به عنوان گروه کنترل انجام گرفت. افراد نرمال دارای هیچ نوع سابقهای از بیماریهای خود ایمنی نبودند. افراد گروه کنترل وبیمار از لحاظ سن همسان سازی شدند. پس از اخذ تاییدیه اخلاقی، برای بررسی ژنوتیپ افراد مورد مطالعه و پس از اخذ رضایت نامه، حدود 5/2 سی سی از خون وریدی افراد مورد پژوهش گرفته و درون لولههای حاوی ماده ضد انعقاد EDTA منتقل شد. نمونههای خون به همراه پرسشنامه مورد نظر، به آزمایشگاه منتقل شدند وسپس نمونهها در دمای 20- درجه سانتی گراد نگه داری شدند.DNA نمونهها با استفاده از کیت GenetBio کره جنوبی طبق پروتوکل پیشنهادی استخراج گردید.
برای انتخاب miRNA مقالات کار شده در زمینه پلی مرفیسم، miRNA و MS مورد بررسی قرار گرفتند و در نهایت mir23a به دلیل عملکردهای مهم در سیستم ایمنی و تمایز لنفوسیتها و همچنین تارگت کردن فاکتور تنظیم کننده اینترفرون انتخاب شد. به منظور مشخص کردن SNP ژن miR 23a، ابتدا توسط سایت NCBI، واریانتهای ژن مورد نظر بررسی شد و سپس طراحی پرایمر توسط چندین نرم افزار انجام گرفت. در ادامه پرایمرهای طراحی شده توسط نرم افزارPrimer (نسخه3) به دلیل اندازه مناسبتر قطعات انتخاب شد. پرایمرهای طراحی شده توسط نرم افزار oligo(نسخه7)، از لحاظ دمای اتصال، تشکیل دایمر پرایمر، تشکیل هیرپین و ... مورد بررسی و آنالیز قرار گرفت و در نهایت با استفاده از سایت Pubmed توالی پرایمرها BLAST گردید. پرایمرها توسط شرکت ماکروژن کره با واسطه شرکت سیناکلون سنتز شد.
واکنش PCR در حجم نهایی 20 میکرولیتر شامل 75/0 میکرولیتر Mgcl2، 5/0 میکرولیتر dNTP، 2/1 میکرولیتر بافر، 8میکرولیتر DNA، 1 میکرولیتر از پرایمرهای داخلی و 2 میکرولیتر پرایمرهای کنترل و تا حجم نهایی 20 آب مقطر استفاده گردید. برنامه PCR به صورت یک مرحله دناتوراسیون اولیه، دردمای 95 درجه سانتی گراد برای مدت 5 دقیقه و در ادامه 34 چرخه شامل دناتوراسیون 95 درجه سانتیگراد برای مدت 45 ثانیه، اتصال پرایمر58درجه سانتی گراد برای مدت 45 ثانیه، دمای 72درجه سانتی گراد برای مدت 40 ثانیه به منظور گسترش انجام شد. در نهایت دمای 72 درجه سانتی گراد برای مدت 10دقیقه به منظور طویل سازی نهایی انجام گرفت (9). در ادامه، محصولات حاصل از واکنش تکثیری با استفاده از ژل آگاروز 1% الکتروفورز شدند. از دستگاه ژل داکیومنتیشن جهت بررسی و عکس برداری استفاده شد.
در این پژوهش، برای تخمین ارتباط بین پلی مرفیسم ژن miR23a با شناسه rs3745453 و ریسک ابتلا به MS با استفاده از آنالیز آماری رگرسیون لجستیک، آزمون تی-تست و نسبت شانس (OR) با فاصله اطمینان 95% مورد استفاده قرار گرفت. در همه محاسبات سطح احتمال05/0 p< از نظر آماری معنی دار در نظر گرفته شد.
نتایج
مشخصات افراد مورد مطالعه، در جدول 2 مشاهده میشود. با توجه به اینکه گروه شاهد و بیمار از لحاظ جنس و سن همسانسازی شده اند، اختلاف آماری معنی داری بین سن افراد سالم و بیمار مشاهده نشد (05/0p>).
در این مطالعه، مقایسه گروه‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های سنی 17تا45 سال در گروه بیمار نشان میدهد که بیشترین میزان ابتلا بهMS در گروه سنی 25 تا35 سال دیده میشود. آنالیز آماری نشان داد بین سابقه بیماری قبلی و ابتلا به MS ارتباط معنی داری وجود ندارد (7/0x2= 05/0> p).
توالی پرایمرها، دمای اتصال و مواد مورد نیاز PCR در جدول1 آمده است.
[1] gliosis
[2] axon degeneration
[3] (RR) Relapsing-Rremitting
[4] Human leukocyte antigen
[5] NK cell
جدول شماره 2، مشخصات افراد در دو گروه کنترل و بیمار را نشان میدهد. همانطور که مشاهده میشود، افراد خانه دار بیشترین فراوانی را در افراد مبتلا به MS تشکیل میدهند.
تعیین ژنوتیپ SNPبا شناسه rs3745453 با تکنیک Tetra Primer ARMS- PCR
ژنوتیپ پلی‌مورفیسم تک نوکلئوتیدی با شناسه rs3745453 در نمونههای بیمار و کنترل با تکنیکTetra Primer ARMS- PCR تعیین شد (جدول3). همانطور که در شکل1 مشخص است برای تعیین ژنوتیپ rs3745453، باند 83 bp7 در همه نمونهها باید وجود داشته باشد که نشان دهنده صحت PCR انجام شده است. اما افرادی که علاوه بر این، دارای باند bp 394 نیز هستند، یعنی ژنوتیپ آنها در این SNP، CC است.
افرادی که علاوه بر باندهای bp 837 و bp 394 دارای باند bp 490 نیز باشند ژنوتیپ آنها TC و اگر فردی فقط دو باند bp 837 و bp 490را داشته باشد TTمیباشد.
نتایج حاصل از تعیین ژنوتیپ های پلی مرفیسم rs3745453 در ژن mir23aدر شکل 1 آمده است.
بحث
میکروRNA (miRNA) RNA های کوچک غیرکدشونده 18 تا23نوکلئوتیدی بوده، که تا کنون نقش آنها در تنظیم پروسههای حیاتی مختلف مانند رشد، سیکل سلولی، تمایز، آپوپتوز، متابولیسم و ایمنی مشخص شده است. علاوه بر این miRNA ها، در فعالیتهای مختلف سلولی مانند ترشح انسولین، سنتز نوروترانسمیترها و ریتم شبانه روزی دخالت دارند.
تخمین زده شده که حدود 60% ازmiRNA های شناسایی شده تا امروز در سیستم عصبی مرکزی (CNS) بیان میشوند. طبق مطالعات اخیر مشخص شده است که miRNA ها نقش مهمی در سیستم ایمنی ذاتی و اکتسابی ایفا میکنند.
علاوه بر این SNP های عملکردی موجود در pre-miRNA میتواند با تغییر حساسیت نسبت به بسیاری از بیماریها مانند انواع سرطان و بیماری های خودایمنی در ارتباط باشد (8).
در زمینه مطالعات پلی مرفیسم miRNA، اخیرا چندین مطالعه صورت گرفته است. هاشمی و همکاران در سال 2016 ارتباط پلی مرفیسمmiR-499, miR-196a2 وmiR-146a و miR-149 را در سرطان پروستات بررسی کردند. در این مطالعه مشخص شد ژنوتیپ CC پلی مرفیسم miR-499 با افزایش ریسک سرطان پروستات در ارتباط است. در سال 2014 نیز هاشمی و همکاران در مطالعهای نشان دادند پلی مرفیسمhsa-miR-146a rs2910164 با افزایش ریسک ALL[1] در ارتباط است (9).
در سال 2015 لی[2] و همکاران در مطالعهای نشان دادند پلی مرفیسم miR-146a با بیماری های خود ایمنی در ارتباط است (10).
کلاستر ژنی miR23a -27a-24-2 در پروسه های بیولوژیک و پاتولوژیک مانند تکوین، تکثیر، تمایز ،آپوپتوز، پاسخ ایمنی و متاستاز نقش مهمی ایفا می کنند.
همچنین بیان غیر نرمال این کلاستر در انواع سرطان ها مانند سینه، پروستات، معده، هپاتوسلولار، کلانژیو کرسینوما و کولورکتال گزارش شده است. الگوی بیانی پیچیده این کلاستر بیان میکند که این کلاستر اختصاص – بافتی عمل میکند به طوری که برخی اعضا در یک نوع سرطان کاهش بیان و برخی افزایش بیان را نشان می دهند (11).
پلی مرفیسم miR23a با شناسه rs3745453 در تنظیم بیان اعضای این کلاستر نقش داشته است . در مطالعهای که یانگ[3] و همکاران در سال 2017 بر روی کپی نامبر واریانتهای چندین miRNA با روش Taq Man PCRانجام دادند مشخص شد، کپی نامبر miR23a در بیماران مبتلا به التهاب قرنیه افزایشی را نشان می دهد (7-11).
در مطالعه حاضر برای اولین بار پلی مرفیسم mir23a با شناسه rs3745453 از طریق تکنیکTARMS PCR مورد بررسی قرار گرفت. در این پژوهش که بر روی 71 فرد مبتلا به MS و 71فرد سالم انجام شد، فراوانی آلل T(wild Type ) در افراد بیمار (6/0) و گروه کنترل نسبت به آلل (3/0) Cبیشتر بود. فراوانی ژنوتیپی TT،TC و CC در افراد بیمار به ترتیب 34، 24، 13% و در افراد گروه کنترل به ترتیب 39، 11، 21%. در هر دو گروه مورد مطالعه، ژنوتیپ TT نسبت به سایر ژنوتیپ ها غالب بود. فراوانی هتروزیگوت ها در افراد بیمار نسبت به گروه کنترل بیشتر بود. به طوری که نسبت شانس (OR) در ژنوتیپ TC برابر با 7/2 بود. به عبارتی افراد با ژنوتیپ هتروزیگوتی، 7/2 برابر نسبت سایر افراد شانس ابتلا به بیماری MS را دارند (029/0=p). در مطالعهای مشابه در ایتالیا ریدولفی[4] و همکاران در سال 2013 با بررسی پروفایل بیانی در افراد MS دریافتند که سطح سرمی miR-15b, miR-223, miR-23a در افراد Ms در مقایسه با نرمال کاهش مییابد. آنها همچنین گزارش دادند فرکانس آلل C در miR-23a با شناسه rs3745453 به طور معنا داری در افراد MS در مقایسه با نرمال افزایش می یابد (12). بنابر این آلل C را در SNP rs3745453 به عنوان ریسک فاکتوری در بیماری MS پیشنهاد دادند. در حالی که بر خلاف نتایج ریدولفی در ایتالیا در این مطالعه، فراوانی آلل T ، واز لحاظ ژنوتیپی هتروزیگوت ها غالب بودند. علت تفاوت نتایج این مطالعه و جمعیت MS ایتالیایی، شاید به دلیل اختلاف تعداد نمونههای بررسی یا نوع نمونه miRNA) های سرم در مقابل خون (باشد.
نتیجهگیری
با توجه به ارتباط پلی مرفیسم miRNA با ریسک ابتلا به MS، پیشنهاد میشود که مطالعات دیگری در آینده، با استفاده از تعداد نمونههای بیشتر و در سایر مناطق کشور نیز صورت گیرد. به نظر می رسد که مطالعه حاضر بتواند به عنوان مقدمه ای برای بررسی ارتباط پلی مرفیسم سایر miRNA ها با بیماری MSگردد.
تشکر و قدردانی
از افراد شرکت کننده در این مطالعه و همچنین از آقای حسینیان مسؤل محترم بیمارستان تامین اجتماعی سپاسگزاری میشود.
)