مسیرهای پیام رسانی TLR به دو دسته وابسته به پروتئین MyD88 و وابسته به پروتئین TRIF طبقه بندی می‎شوند. در پاسخ به لیگاندها و برای تولید سایتوکاین های التهابی، تمامی TLR‎ها به جز TLR3 از مسیر پیام رسانی وابسته به پروتئین MyD88 بهره می‎برند (شکل 2). این مسیر آبشارهای MAPK، IRF1، IRF3، و IRF7 را برای تحریک تولید سایتوکاین‌ها شامل اینترفرون‌های نوع I و سایتوکاین‌های پیش التهابی فعال می‌کند. فسفریله شدن فاکتورهای تنظیمی اینترفرون (به‌ویژه TLR3 و (TLR7 که توسط کمپلکس کینازی IKKε و TBK1 در سلول‌های اپی‌تلیال فعـال می‌شوند، میانجـی تولید IFN-β وابسته به TRIF است. پروتئین IRF فعال شده با برهم کنش با پروتئین اتصال- CREB رونویسی از IFN-β را فعال می‌کند. افزون بر IRF-3، فعال سازی فاکتور رونویسی NF-κB وابسته به TRIF در مسیر انتقال پیام TLR واسطه‌ تولید IFN-β است. فعال شدن TRIF سبب آغاز یک‌سری از برهم کنش‌ها بین TRAF6 و یک کمپلکس پروتئین کیناز متشکل از TAK1، TAB1، TAB2 و TAB3 می‌شود. کمپلکس TAK1 کیناز فعال شده، سپس مسیر انتقال پیام IKK/NF-κB، هم‌چنین MEKK6/JNK و MEKK6/p38 MAP کیناز را فعال می‌کند (24-25).پیام رسانی TLR3 با دیگر TLR‎ها متفاوت بوده و فقط وابسته به مسیر TRIF است. در پیام رسانی TLR3 و پیام رسانی TLR4 غیروابسته بهMyD88 ، پروتئین‌های TRIF، TBK1، و TRAF6 به دامنه سیتوپلاسمی TLR3 متصل می‌شوند. پروتئین IRF-3 اینترفرون‌های نوع I را فعال می‌کند و P13K سبب افزایش فعالیت این پروتئین می‌شود. در سلول‌های اپی‌تلیال میزبان، پروتئینTRIF کمپلکس TBK1/IKKε کیناز را فعال کرده و TRAF6 و RIP1 را برای تحریک مسیر انتقال پیام NF-κB القا می‌کند. علاوه بر این، پروتئین TRAF6 برای فعال کردن آبشارهای MAPK با کمپلکس TAK1-TAB1/2/3 برهم کنش دارد. پروتئین های تطبیق دهنده‎دیگری نیز ممکن است در القا اینترفرون توسط سایرTLR ها، مانند TLR7 و TLR9 شرکت داشته باشند (31، 17، 15).

TLR‎ها به عنوان مولکول‎های فزاینده پاسخ‎های ایمنی

ایمن سازی موفق مستلزم انجام یک سری برهم کنش‎های ایمنی در میزبان است. سلول‎های ایمنی شامل لنفوسیت‎های B و APC‎ها (DC‎ها و ماکروفاژها) آنتی ژن واکسن را گرفته و ذخیره می‎کنند (32). DC‎ها کارآمد ترین سلول‎های عرضه کننده آنتی ژن برای فعال سازی سلول‎های T و پیامد آن آغاز پاسخ‎های ایمنی هستند. عملکرد این سلول‎ها در القا ایمنی با بلوغ و فعال شدن آن‎ها تنظیم می‎شود که طی پیام رسانی TLR و تولید سایتوکاین‎های پیش التهابی، کموکاین‎ها و اینترفرون‎های نوع I صورت می‎گیرد (33، 3، 1). پاسخ ایمنی ذاتی، ایمنی اکتسابی را به دنبال داشته و می‎تواند القای پاسخ‎های خاص واکسن را افزایش دهد. TLR‎ها به طور اختصاصی بر روی DC‎ها عمل کرده و با افزایش تحویل آنتی‌ژن به APC‎ها سبب هدایت آن به سمت مولکول‌های MHCI و MHCII و تولید بیش‌تر اینترفرون‎ها و سایتوکاین‎های التهابی می‌شوند. اینترفرون نوع I القا کننده ایمنی با تحریک DC و مشارکت آنتی ژن‎های MHC است که DC‎ها را قادر به فعال کردن سلول‎های B می‎کند (24، 16). DC‎های بالغ با عرضه آنتی ژن بر روی سطح سلول، به طور مستقیم پیش برنده بیان پذیرنده‎های سلول B هستند که نتیجه آن برهم کنش‎های متوالی با Th‎ها برای شروع ترشح آنتی بادی است (29). سایتوکاین‎ها نیز نقش زیستی خود را با پیوند به پذیرنده هـای ویـژه روی غشای سلول های هدف انجام می‎دهند. این پذیرنده‎ها از نظر ساختاری بسیار گوناگون هستند شامل پذیرنده‎های سایتوکاینی رده I وII ، TNF، اینترفرون، و ایمونوگلوبولین. پذیرنده IL-1 عضوی از خانواده پذیرنده‎های ایمونوگلوبولین است که بر روی سلول‎های B و سلول‎های دیگر بیان می‎شود. افزایش پاسخ‌های ایمنی با استفاده از این یاورهای زیستی به دلیل ایجاد پیام‌های کمک تحریکی برای هدایت لنفوسیت‌ها به سمت پاسخ ایمنی و ترشح فاکتورهای محرک مانند IL-1 است که بر روی تکثیر لنفوسیت‌ها تاثیر می‌گذارد (34، 13).دامنه TIR در تنظیم TLR و مسیر انتقال پیام داخلی IL-1 دخالت می‎کند. این سایتوکاین سبب فعال سازی Th1 و القا افزایش بیان ژن هایی می‎شود که در تکثیر و پایداری سلول‌های B نقش دارند (21). دامنه TIR فعالیت خود را از چندین مسیر انتقال پیام داخلی مانند به خدمت گرفتن پروتئین MyD88، و فعال کردن فاکتورهای تنظیمی اینترفرون پیش می‌برد که سبب تکثیر لنفوسیت‌های T فولیکولاری در pDC‎ها می‌شوند. این سلول‌های فولیکولاری نوعی T CD4+ هستند که به دنبال شروع آبشار انتقال پیام TLR، ایمنی هومورال را در واکنش علیه آنتی‌ژن‌های پروتئینی فعال می‌کنند (23، 21، 3).

TLR‎ها اگرچه بر روی DC ها، ماکروفاژها و لنفوسیت‎ها بیان می‎شوند اما از نظر مکان یابی (غشا پلاسما یا درون سلول)، استفاده از پروتئین‎های تطبیق دهنده برای القا و پیام رسانی (TIRAP، TRIF، TRAM و MyD88)، نوع لیگاند و پاسخی که القا می‎کنند (Th1 یا Th2 و پاسخ‎های التهابی) از یکدیگر متفاوت هستند. TLR‎های یک تا شش بجز سه، روی غشا پلاسمایی سلول قرار دارند و TLR‎های هفت تا نه در محدوده‎ی اندوزومی مکان یابی می‎شوند. این تفاوت‎ها، ماهیت پاسخ‎های ایمنی سلولی و ایمنی هومورال را به هنگام استفاده از TLR‎ها به عنوان یاور تحت تاثیر قرار می‎دهد (20، 15). به عنوان مثال، تحریک TLR2 سبب القای بلوغ DC شده که به تنظیم فرادست پیام‎های محرک مولکول‎های MHC کلاس II، CD80، CD83 و IL-12، و آزادسازی سایتوکاین‎های TNF، و IL-1 منجر می‎شود. در نهایت بلوغ و فعالیت سلول‎های B، افزایش تولید IgG و پاسخ ایمنی هومورال را در پی خواهد داشت (36-35). TLR3 فقط با پروتئین TRIF پیوند برقرار می‎کند. با تحریک این پذیرنده، فعال شدن آبشار انتقال از طریق NF-kB، MAP kinases و IRF3 صورت می‎گیرد و تولید سایتوکاین‎های التهابی و اینترفرون‎های نوع I به بالاترین حد خود می‎رسد. راه اندازی این آبشار، سبب تسهیل ارایه آنتی ژن به مولکول هایMHC  کلاس I و تسریع تولید سلول‎های T سیتوتوکسیک می‎شود. بنابراین، با هدف راه اندازی پاسخ ایمنی سلولی قوی تر در ایمن سازی علیه عوامل بیماری زا، TLR3 یاور مناسبی خواهد بود (37، 27). علاوه بر سلول‎های سیستم ایمنی ذاتی، TLR4 توسط بسیاری از سلول‎های غیرایمنی مانند فیبروبلاست و سلول‎های اپی تلیال بیان می‎شود. این پذیرنده تولید اینترفرون‎های نوع I را از هر دو مسیر MyD88 و TRIF تحریک می‎کند. فعال سازی TLR4 سبب تولید IL-12p70 می‎شود که به طور قابل توجهی پاسخ‎های ایمنی سلولی و ایمنی هومورال را افزایش می‎دهد (38، 20). TLR5 در سطح بسیاری از سلول‎های ایمنی مانند مونوسیت‎ها، mDC‎ها، سلول‎های لانگرهانس، سلول‎های T و سلول‎های NK یافت می‎شود. این پذیرنده سبب بلوغ DC و تنظیم پیام‎های محرک مولکول‎های CD80، CD83، CD86، TNFα، IL-8، IL-1β، CCL2، و CCL5 می‎شود. TLR5 با مشارکت آنتی ژن‎های MHC کلاس II که در سطح سلول‎های APC بیان می‎شوند، DC‎ها را قادر به فعال کردن سلول‎های B و القا ایمنی هومورال می‎کند (40، 39).

TLR9 توسط سلول‎های B انسان و pDC بیان می‎شود. این پذیرنده موتیف‎های CpG غیرمتیله موجود در DNA را پیدا می‎کند. شناسایی CpG DNA توسط سلول‎هایی که TLR9 را بیان می‎کنند دارای اثر آبشاری بر سیستم ایمنی بدن است و به بلوغ، تمایز و تکثیر سلول‎های NK، سلول‎های T، سلول‎های B، منوسیت‎ها و ماکروفاژها منجر می‎شود. پاسخ ایمنی با واسطه سلولی با تولید سایتوکاین‎های پیش التهابی بر پایه Th1 (مانند IL-1، IL-6، TNFα، IFNɣ و IL-12) ایجاد می‎شود (42-41، 20). TLR7 و TLR8 از نظر فیلوژنتیکی و ساختاری شبیه هم هستند و بلوغ سلول‎های لانگرهانس و مهاجرت آن‎ها از پوست به گره‎های لنفاوی را افزایش می‎دهند. پیام‌های داخل سلولی TLR7 فقط توسط pCD گرفته می‌شوند در حالی که فعال سازی TLR8، سبب تولید IL-12 توسط mDCs‎ها می‎شود (43). پیامد فعال شدن مسیر آبشاری پیام رسانی TLR7، این مولکول پروتئین MyD88 را از طریق دامنه TIR به خدمت می‎گیرد. MyD88، پروتئین IRAK که پذیرنده IL-1 است را فعال می‎کند. فعال شدن TLR7 به تولید سایتوکاین التهابی شامل اینترفرون نوع I، IL-6، IL-12، TNF-α، تنظیم فرادست CD40، CD86، و مولکول‎های MHC منجر می‎شود. پیامد پاسخ‎های سایتوکاین‎ها و اینترفرون ها، pCD‎ها به APC‎ها تمایز یافته و توانایی تنظیم ایمنی اکتسابی باواسطه سلول T را کسب می‎کنند (44، 23، 20). تحریک TLR7 هم چنین پیش برنده تعویض کلاس ایمنوگلوبولین و تولید آنتی بادی است. فسفریله شدن پروتئین MAPK یکی از عوامل پیش برنده فعال شدن سلول B و پدیدار شدن سلول‎های پلاسما ترشح کننده آنتی بادی، و در نهایت تولید آنتی بادی است. از طرف دیگر، تشکیل کمپلکسی از پروتئین‎های پذیرنده TNF و IL-1 (IRAKs/TRAF6) به فعال شدن IRF7 که تنظیم کننده عمده تولید اینترفرون نوع I است منجر می‎شود. اینترفرون نوع I مشتق از pDC و گیرنده آن برای تنظیم پاسخ‎های TLR7 در سلول‎های B مورد نیازند زیرا پیام‎های TLR7 با پیام‎های گیرنده سلول‎های B در پیشبرد سلول‎های عرضه کننده آنتی ژن از طریق تنظیم فرادست مولکول‎های محرک و تولید سایتوکاین هم خوان هستند و ظرفیت عرضه آنتی ژن در DC‎ها را افزایش می‎دهند. در تنظیم پاسخ‎های سلول B وابسته به TLR، TLR7 به عنوان یک کوفاکتور سلول‌های B که دارای CD₄₀ هستند عمل می‎کند. برآیند پیام هایCD₄₀  و سایتوکاین‎ها که APC‎ها را فعال می‎کند به افزایش توانایی این سلول‎ها در پردازش و عرضه آنتی ژن و در نتیجه به افزایش بیان مولکول‎های کمک محرک و ترشح سایتوکاین‎ها می‎انجامد. این امر افزایش فعال سازی سلول‎ها یT  را به همراه دارد. این برهم کنش دوطرفه بین APC‎ها و لنفوسیت‎های T شناسایی کننده آنتی ژن، چرخه بازخورد (فیدبک) مثبتی است که به تقویت پاسخ ایمنی کمک کرده و با تنظیم فرادست تولید سایتوکاین‎ها سبب تعویض کلاس ایمنوگلوبولین و پیشبرد تولید آنتی‌بادی می‌شود (29، 28، 25، 3).  دامنه TIR این پذیرنده نقش کلیدی در القای اینترفرون نوع I و افزایش پاسخ‎های ایمنی هومورال دارد. افزایش اثربخشی آن بر پاسخ ایمنی به دلیل ایجاد پیام‌های کمک تحریک برای هدایت لنفوسیت‌ها به سمت پاسخ ایمنی و ترشح فاکتورهای محرک مانند IL-1 است که بر روی تکثیر لنفوسیت‌ها تاثیر می‌گذارد (21، 11، 8).

اینترفرون نوع I با فعال سازی DC‎ها، تنظیم کننده سلول‎های مرتبط با سیستم‎های ایمنی ذاتی و ایمنی اکتسابی است. این سلول‎ها با عرضه آنتی ژن‎ها بر روی سطح سلول، به طور مستقیم پیش برنده بیان گیرنده‎های سلول B هستند که نتیجه آن برهم کنش‎های متوالی با Th‎ها برای شروع ترشح آنتی بادی است. یکی از مهم‌ترین عملکردهای یاورها علاوه بر تسریع در برانگیخته شدن، افزایش و پایداری پاسخ ایمنی، شناسایی آنتی‌ژن توسط DC‎ها و تحویل آن به سلول‌های T است که به فعال سازی، ازدیاد و تمایز سلول‌های اختصاصی آنتی‌ژنCD8+  یا CD4+ منجر می‌شود. هر یاوری که جذب آنتی ژن توسط DC‎ها را بیشتر کند و ذخیره پایداری از آنتی‎ژن برای APC‎ها فراهم نماید، سبب افزایش بیان مولکول‎های محرک پاسخ‎های ایمنی یا مولکول های MHC شده و با افزایش مهاجرت سلولی به سوی گره‎های لنفاوی می‎تواند پاسخ ایمنی را بهبود ببخشد (44-45، 13، 6). استفاده از TLR‎ها به عنوان القا کننده های ایمنی موثر در فعالیت و بلوغ DC‎ها، که سبب برانگیخته شدن و افزایش پاسخ ایمنی شوند بی آن که اثرات جانبی برای میزبان در بر داشته باشند، یک ایده نوین برای ارتقا سطح توانمندی واکسن‎ها است. بیان زیاد TLR‎ها در DC‎های سلول B و روند پیام رسانی آن‎ها در ارایه بهتر آنتی ژن از طریق DC‎ها، و در نهایت تحریک هرچه بهتر و پایدارتر سیستم ایمنی میزبان از مزایای این پذیرنده‎ها به عنوان یاور زیستی درمطالعات ایمن سازی به شمار می‎آیند.

References

1)       Kawai T, Akira S. The role of pattern-recognition receptors in innate immunity:‎update on Toll-like receptors. Nat Immunol 2010; 11:373-84.

2)       Allenspach EJ, Lemos MP, Porrett PM, Turka LA, Laufer TM. Migratory and lymphoid-resident dendritic cells cooperate to efficiently prime naive CD4 T cells. Immunity 2008; 29:795-806.

3)       Granucci F, Zanoni I, Ricciardi-Castagnoli P. Central role of dendritic cells in the regulation and deregulation of immune responses. Cell Mol Life Sci 2008; 65:1683-97.

4)       Kabelitz D, Medzhitov R. Innate immunity–cross-talk with adaptive immunity through pattern recognition receptors and cytokines. Curr Opin Immunol 2007; 19:1-3.

5)       Awate S, Babiuk LA, Mutwiri G. Mechanisms of action of adjuvants. Front Immunol 2013; 4:114.

6)       Lima KM, dos Santos SA, Rodrigues JR, Silva CL. Vaccine adjuvant: it makes the difference. Vaccine 2004; 22:2374-9.

7)       Petrovsky N, Aguilar JC. Vaccine adjuvants: current state and future trends. Immunol Cell Biol 2004; 82:488-96.

8)       Shahsavandi S, Ebrahimi MM, Mahravani H, Saedghi K. Design of a heterosubtypic epitope-based peptide vaccine fused with hemokinin-1 against influenza viruses. Virol Sin 2015; 3:200-7.

9)       Ebrahimi MM, Shahsavandi S, Shayan P, Goudarzi H, Masoudi S. An immunoinformatic assay to design bio adjuvanted vaccine against infectious Bursal disease virus. J Biol Today's World 2016; 5:13-9.

10)   Soleimani S, Shahsavandi S, Madadgar O, Mahravani H, Lotfi M. In silico analysis of HA2/Mx chimera peptide for developing an adjuvanted vaccine to induce immune responses against influenza viruses. Adv Pharma Bull 2015; 5:629-36.

11)   Ebrahimi MM, Shahsavandi S, Shayan P, Goudarzi H, Masoudi S. Recombinant VP2 expressed in baculovirus and adjuvanted with TIR-TLR7: a vaccine candidate against infectious bursal disease virus. Comp Clin Pathol 2018; 27:911.

12)   Aiyer Harini P, Ashok Kumar HG, Praveen Kumar G, Shivakumar N. An overview of immunologic adjuvants-a review. J Vaccines Vaccinat 2013; 4:1-4.

13)   Tovey MG, Lallemand C. Adjuvant activity of cytokines. Methods Mol Biol 2010; 626:287-309.

14)   Soleimani S, Shahsavandi S, Madadgar O. Improvement influenza HA2 DNA vaccine cellular and humoral immune responses with Mx bio adjuvant. Biologicals 2017; 46:6-10.

15)   Takeda K, Kaisho T, Akira S. Toll-like receptors. Annu Rev Immunol 2003; 21:335-76.

16)   Hopkins PA, Sriskandan S. Mammalian Toll-like receptors: to immunity and beyond. Clin Exp Immunol 2005; 140:395-407.

17)   Kawai T, Akira S. Signaling to NF-kappaB by Toll-like receptors. Trends Mol Med 2007; 13:460-9.

18)   Kumar H, Kawai T, Akira S. Toll-like receptors and innate immunity. Biochem Biophys Res Commun 2009; 388:621-5.

19)   Zarember KA, Godowski PJ. Tissue expression of human Toll-like receptors and differential regulation of Toll-like receptor mRNAs in leukocytes in response to microbes, their products, and cytokines. J Immunol 2002; 168:554-61.

20)   Kawasaki T, Kawai T. Toll-like receptor signaling pathways. Front Immunol 2014; 5:461-5.

21)   Ve T, Williams SJ, Kobe B. Structure and function of Toll/interleukin-1 receptor/resistance protein (TIR) domains. Apoptosis 2015; 20:250-61.

22)   Pasare C, Medzhitov R. Toll-like receptors: linking innate and adaptive immunity. Adv Exp Med Biol 2005; 560:11-8.

23)   O'Neill LA, Bowie AG. The family of five: TIR-domain-containing adaptors in Toll-like receptor signalling. Nat Rev Immunol 2007; 7:353-64.

24)   Kawai T, Akira S. TLR signaling. Cell Death Differ 2006; 13:816-25.

25)   Colonna M. TLR pathways and IFN-regulatory factors: to each its own. Eur J Immounol 2007; 37:306-9.

26)   Krishnan J, Selvarajoo K, Tsuchiya M, Lee G, Choi S. Toll-like receptor signal transduction. Exp Mol Med 2007; 39:421-38.

27)   Kawai T, Akira S. Toll-like receptor and RIG-I-like receptor signaling. Ann N Y Acad Sci 2008; 1143:1-20.

28)   Honda K, Yanai H, Negishi H, Asagiri, M, Sato M, Mizutani T, et al. Nature 2005; 434:772-7.

29)   Pasare C, Medzhitov R. Control of B-cell responses by Toll-like receptors. Nature 2005; 438:364-8.

30)   Kawasaki T, Kawai T. Toll-like receptor signaling pathways. Front Immunol 2014; 5:461-5.

31)   Fukao T, Koyasu S. PI3K and negative regulation of TLR signaling. Trends Immunol 2003; 24:358-63.

32)   Ohteki T, Koyasu S. Role of antigen-presenting cells in innate immune system. Arch Immunol Ther Exp 2001; 49:S47-52.

33)   Creagh EM, O’Neill LA. TLRs, NLRs and RLRs: a trinity of pathogen sensors that co-operate in innate immunity. Trends Immunol 2006; 27:352-7.

34)   Asif M, Jenkins KA, Hilton LS, Kimpton WG, Bean AG, Lowenthal JW. Cytokines as adjuvants for avian vaccines. Immunol Cell Biol 2004; 82:638-43.

35)   Hertz CJ, Kiertscher SM, Godowski PJ, Bouis DA, Norgard MV, Roth MD, et al. Microbial lipopeptides stimulate dendritic cell maturation via Toll-like receptor 2. J Immunol 2001; 166:2444-50.

36)   Jackson DC, Lau YF, Le T, Suhrbier A, Deliyannis G, Cheers C, et al. A totally synthetic vaccine of generic structure that targets Toll-like receptor 2 on dendritic cells and promotes antibody or cytotoxic T cell responses. Proc Natl Acad Sci U S A 2004; 101:15440-5.

37)   Alexopoulou L, Holt AC, Medzhitov R, Flavell RA. Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappaB by Toll-like receptor 3. Nature 2001; 413:732-8.

38)   Park BS, Song DH, Kim HM, Choi BS, Lee H, Lee JO. The structural basis of lipopolysaccharide recognition by the TLR4-MD-2 complex. Nature 2009; 458:1191-5.

39)   Means TK, Hayashi F, Smith KD, Aderem A, Luster AD. The Toll-like receptor 5 stimulus bacterial flagellin induces maturation and chemokine production in human dendritic cells. J Immunol 2003; 170:5165-75.

40)   Hayashi F, Smith KD, Ozinsky A, Hawn TR, Yi EC, Goodlett DR, et al. The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by Toll-like receptor 5. Nature 2001; 410:1099-103.

41)   Hartmann G, Krieg AM. Mechanism and function of a newly identified CpG DNA motif in human primary B cells. J Immunol 2000; 164:944-53.

42)   Krug A, Rothenfusser S, Hornung V, Jahrsdorfer B, Blackwell S, Ballas ZK, et al. Identification of CpG oligonucleotide sequences with high induction of IFNa/b in plasmacytoid dendritic cells. Eur J Immunol 2001; 31:2154-63.

43)   Jurk M, Kritzler A, Schulte B, Tluk S, Schetter C, Krieg AM, et al. Modulating responsiveness of human TLR7 and 8 to small molecule ligands with T-rich phosphorothiate oligodeoxynucleotides. Eur J Immunol 2006; 36:1815-26.

44)   Bao M, Liu YJ. Regulation of TLR7/9 signaling in plasmacytoid dendritic cells. Protein Cell 2013; 4:40-52.

45)   Ishii KJ, Akira S. Toll or toll-free adjuvant path toward the optimal vaccine development. J Clin Immunol 2007; 27:363-71.