بررسی مولکولی ژن های مقاومت تتراسایکلین در باکتری شیگلا سونئی جدا شده از نمونه بالینی و اثر عصاره علف چشمه (Nasturtium officinal) بر بیان ژن مقاومت به روش Real time- PCR

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 کارشناس ارشد میکروبیولوژی، گروه بیولوژی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تهران مرکزی، تهران، ایران

2 استاد گروه پاتوبیولوژی، دانشکده علوم تخصصی دامپزشکی،دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم و تحقیقات، تهران،ایران

3 دانشیار، گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم پایه، واحد ساوه، دانشگاه آزاد اسلامی، ساوه، ایران

چکیده

مقدمه: شیگلا (Shigella) باسـیل گـرم منفـی روده ای کـه عفونـتهـای ناشـی از آن مـشکلات جـدی را در کـشورهای پیشرفته و در حال توسعه ایجاد کرده اسـت. شیوع عفونـتهـای ناشـی از شـیگلا بـه دلیـل دوز پـایین بیماریزایی این باکتری و همچنین انتقال آسان آن از فـردی بـه فرد دیگر و نیز آلوده شدن غیرمستقیم افـراد از طریـق مـصرف مواد غذایی و آب آلوده بسیار آسان است.  جداسازی شیگلا سونئی از مدفوع کودکان, تاثیر و جداسازی عصاره گیاه علف چشمه, جدا سازی مولکولی ژن های تتراسایکلین با روش مالتی پلکس PCR و  تاثیر عصاره بر بیان ژن مقاومت تتراسایکلین باروش مالتی پلکس PCR است.
روش کار: از تعداد 60 سوش شیگلا سونئی جدا شده از کودکان مبتلا به اسهال پس از ایزولاسیون سویه ها بر روی محیط های افتراقی و محیط  کشت (MAC) MacConkey Agar از نظر شکل و رنگ کلنی ها بررسی و ثبت شد. ابتدا DNA ی هر یک از نمونه­ ها توسط کیت استخراج DNA استخراج شد و پس از استخراج نسبت به تکثیر DNA الگو به روش PCR اقدام ­شد. برای بررسی اثر مقاومت آنتی بیوتیکی گیاه علف چشمه نسبت به ژن استخراج شده مقاوم به داروی تتراسایکلین، MIC عصاره گیاه بر روی غلظت های مختلف باکتری شیگلا سونئی بررسی شد. از سویه هایی که واجد ژن های مقاوم به تتراسیکلین می باشند با در نظر گرفتن  MIC، با استفاده دو گروه تیمار و غیر تیمار، پس از انکوباسیون 18 ساعته stationary lag log با استفاده از کیت استخراج RNA x plus استخراج RNA انجام شد. سپس با استفاده از دستگاه RT-PCR ABI plus  میزان بیان ژنtet A  و tet B در دو گروه تیمار و غیرتیمار تحت تاثیر عصاره گیاه علف چشمه بصورت کمی (عددی) CT خوانده شد و بیان ژن تحت تاثیر تیمار، تفسیر گردید.
نتایج: نتایج ایزوله شیگلا سونئی درصد بالایی از بیشترین مقاومت به استرپتومایسین، نالیدیکسیک اسید، تتراسایکلین و آمپی سیلین و کلرامفنیکل با 100%، 100%، 7/86% و 8/91% % و 50 % مشاهده شد. هم چنین بیشترین حساسیت به جنتامایسین و سیپروفلوکساسین با 85% و 6/86% مشاهده شد. نتایج PCR چند گانه نشان داد که، از تمامی 60 ایزوله شیگلا سونئی ، 3 ایزوله فقط دارای ژن tetB (5%)، 55 ایزوله دارای ژن tetA (6/91%)، بودند. نتایج حاصل از آزمون فیشر حاکی از آنست که در سطح خطای 5 درصد ارتباط معناداری بین ژنهای tetA و مقاومت به آنتی­بیوتیک­ها وجود داشته است(05/0p-value <).  نتایج حاکی از آن بود که در سطح خطای 5 درصد ارتباط معناداری بین ژنهای tetB با مقاومت به آنتی­بیوتیک­ها وجود نداشته است(05/0p-value =). نتایج حاکی از آن بود که در سطح خطای 5 درصد ارتباط معناداری بین ژنهای مثبت و منفی کلیه ژنها با مقاومت به آنتی­بیوتیک­ها وجود نداشته است(05/0p-value <).
نتیجه گیری: در نتیجه آنکه مقاومت چندگانه در ایزوله های شیگلا به اکثر آنتی بیوتیک ها از جمله تتراسایکلین، کرامفنیکل، آمپی سیلین، کوتریموکسازول، نالیدیکسیک اسید و فلوروکینولون ها و هم چنین سفالوسپورین های نسل سوم در نقاط مختلف جهان رو به افزایش است. پارامتر Fold change نیز بیانگر میزان Fold change   گروه تیمار نشده نسبت به گروه تیمار شده می باشد. میزان Fold Change برای ژن tetA برابر 21/1- که نشان می دهد این ژن در گروه تیمار شده با عصاره گیاه علف چشمه نسبت به گروه غیر تیمار شده 21/1برابر کاهش یافته است.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Molecular study of tetracycline resistance genes in Shigella sonnei isolated from clinical samples and the effect of spring grass extract on the expression of resistance gene by Real time-PCR method

نویسندگان [English]

  • Shokofeh Ahmadzadeh 1
  • Mansour Bayat 2
  • Kumarss Amini 3
1 Master of Microbiology, Department of Biology, Faculty of Basic Sciences, Islamic Azad University, Central Tehran Branch, Tehran, Iran
2 Professor,Department of Pathobiology,Faculty of Veterinary Specialized Sciences,Islamic Azad University,Science and Research Branch,Tehran,Iran
3 Associate Professor, Department of Microbiology, Faculty of Basic Sciences, Saveh Branch, Islamic Azad University, Saveh, Iran
چکیده [English]

Introduction: Shigella is a gram-negative intestinal bacillus whose infections have caused serious problems in developed and developing countries. The prevalence of Shigella infections is very low due to the low dose of pathogenicity of this bacterium as well as its easy transmission from one person to another and also the indirect contamination of people through the consumption of contaminated food and water. Objective of isolation of Shigella sonnei from children's feces, Effect and isolation of spring grass extract, Molecular isolation of tetracycline genes by multiplex PCR, Effect of extract on tetracycline gene expression by multiplex PCR.
Methods: Out of 60 Shigella sonnei strains isolated from children with diarrhea after isolation of strains on different media and MacConkey Agar (MAC) medium in terms of shape and color of colonies were examined and recorded. First, the DNA of each sample was extracted by a DNA extraction kit, and after extraction, the DNA of the template was amplified by PCR. To investigate the effect of antibiotic resistance of spring grass to the extracted gene resistant to tetracycline, MIC of plant extract on different concentrations of Shigella sonnei was investigated. Strains with tetracycline-resistant genes were treated with MIC, using both treatment and non-treatment groups, and after incubation for 18 hours, stationary lag log was performed using RNA extraction kit x plus RNA extraction. Then, using RT-PCR ABI plus device, the expression of tet A and tet B genes in the treated and untreated groups under the influence of spring grass extract was read quantitatively (numerically) CT and the expression of the gene under the influence of treatment was interpreted.
Results: Shigella sonnei isolated results showed a high percentage of the highest resistance to streptomycin, Nalidixic acid, tetracycline and ampicillin and chloramphenicol with 100%, 100%, 86.7%, 91.8% and 50%. Also, the highest sensitivity to gentamicin and ciprofloxacin was observed with 85% and 86.6%, respectively. Multiple PCR results showed that out of all 60 Shigella sonnei isolates, 3 isolates had only tetB gene (5%) and 55 isolates had tetA gene (91.6%).
Conclusion: The results of Fisher test indicate that there was a significant relationship between tetA genes and antibiotic resistance at 5% error level (p-value <0.05). The results showed that at the 5% error level there was no significant relationship between tetB genes and antibiotic resistance (p-value = 0.05). The results showed that at the 5% error level, there was no significant relationship between positive and negative genes of all genes with antibiotic resistance (p-value <0.05).

کلیدواژه‌ها [English]

  • Shigella sonnei
  • spring grass plant
  • aqueous extract
  • tetracycline resistance gene
  • PCR

مراجع

  1. Rrahman F, Klementina P, Qenan M, Beqe H, Kemajl B. ANALYSES OF microbiological data indicates from
    physic-chemcal parameters, in fish species from sitnica, lepenci and lumbardhi i prizrenit rivers (kosova).
    international journal of ecosystems and ecology science-ijees. 2015;5(2):207-12.
  2. 2. Hallaç B. determination of prevalence and incidence of Salmonella spp. and Shigella spp. in some foods in
    iraq/sulaymaniyah/qaladze: Siirt Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü; 2017.
    3. Jones CH, Tuckman M, Murphy E, Bradford PA. Identification and sequence of a tet (M) tetracycline resistance
    determinant homologue in clinical isolates of Escherichia coli. Journal of bacteriology. 2006;188(20):7151-64.
    4. Low DE. Nonpneumococcal streptococcal infections, rheumatic fever. Goldman's Cecil Medicine: Elsevier;
    2012. p. 1823-9.
    5. Ramos JL, Martínez-Bueno M, Molina-Henares AJ, Terán W, Watanabe K, Zhang X, et al. The TetR family of
    transcriptional repressors. Microbiology and molecular biology reviews. 2005;69(2):326-5.6
    6. Allard J, Bertrand K. Membrane topology of the pBR322 tetracycline resistance protein. TetA-PhoA gene fusions
    and implications for the mechanism of TetA membrane insertion. Journal of Biological Chemistry.
    1992;267(25):17809-19.
    7. Sapunaric FM, Levy SB. Substitutions in the interdomain loop of the Tn10 TetA efflux transporter alter
    tetracycline resistance and substrate specificity. Microbiology. 2005;151(7):2315-22.
    8. Parsaei P, Bahmani M, Naghdi N, Asadi-Samani M, Rafieian-Kopaei M, Sepehri-Boroujeni M. Shigellosis
    phytotherapy: A review of the most important native medicinal plants in Iran effective on Shigella. Der Pharmacia
    Lettre. 2016;8(2):249-55.
    9. Davidson A. The Oxford companion to food: OUP Oxford; 2014.
    10. Onyimonyi A, Olabode A, Okeke G. Performance and economic characteristics of broilers fed varying dietary
    levels of neem leaf meal (Azadirachta indica). International Journal of Poultry Science. 2009;8(3):256-9.
    11. Nair MP, Kandaswami C, Mahajan S, Chadha KC, Chawda R, Nair H, et al. The flavonoid, quercetin,
    differentially regulates Th-1 (IFNγ) and Th-2 (IL4) cytokine gene expression by normal peripheral blood
    mononuclear cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 2002;1593(1):29-36.
    12. Fennell J. Potential for watercress production in Australia. Rural Industries Research and Development
    Corporation, Kingston ACT, Australia. 2006.
    13. KASAI K. Amplification of a variable number of tandem repeats (VNTR) locus variable number of tandem
    repeats (VNTR) locus( pMCT 118) by polymerase chain reaction (PCR) and its amplification. J Forens Sci.
    1990;35:1196-200.
    14. Dolatshahi Z, Amini K. Survey of tetracycline resistance genes in Shigella sonnei isolated from acute pediatric
    with bacterial diarrhea using Multiplex PCR method and their antibiotic resistance patterns. Zanko journal of
    Medical sciences. 2016;17(52):35-44.
    15. Sayers EW, Barrett T, Benson DA, Bolton E, Bryant SH, Canese K, et al. Database resources of the national
    center for biotechnology information .Nucleic acids research. 2012;40(D1):D13-D25.
    16. Ardavan A, Rival O, Morton JJ, Blundell SJ, Tyryshkin AM, Timco GA, et al. Will spin-relaxation times in
    molecular magnets permit quantum information processing? Physical review letters. 2007;98(5):057201.
    17. Croy R. Molecular Genetics II-Genetic Engineering Course (Supplementary notes). Durham University durham ac
    uk. 1998.
    18. Asadi M, Mirvaghefei A, Nematollahi M, Banaee M, Ahmadi K. Effects of Watercress (Nasturtium nasturtium)
    extract on selected immunological parameters of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Open Veterinary Journal.
    2012;2(1):32-9.
    19. Hartman AB, Essiet II, Isenbarger DW, Lindler LE. Epidemiology of tetracycline resistance determinants in
    Shigella spp. and enteroinvasive Escherichia coli: characterization and dissemination of tet (A)-1. Journal of
    Clinical Microbiology. 2003;41(3):1023-32.
  3. 20. Penatti M, Hollanda L, Nakazato G, Campos T, Lancellotti M, Angellini M, et al. Epidemiological
    characterization of resistance and PCR typing of Shigella flexneri and Shigella sonnei strains isolated from
    bacillary dysentery cases in Southeast Brazil. Brazilian Journal of Medical and Biological Research.
    2007;40(2):249-58.
    21. Davies JR, Farrant W, Tomlinson A. Further studies on the antibiotic resistance of Shigella sonnei: I. Transferable
    antibiotic resistance. Epidemiology & Infection. 1968;66(3):471-7.
    22. Shahsavan S, Owlia P, Lari AR, Bakhshi B, Nobakht M. Investigation of efflux-mediated tetracycline resistance
    in Shigella isolates using the inhibitor and real time polymerase chain reaction method. Iranian journal of
    pathology. 2017;12(1):53.
    23. Pons MJ, de la Peña AT, Mensa L, Martón P, Ruiz-Roldán L, Martínez-Puchol S, et al. Differences in tetracycline
    resistance determinant carriage among Shigella flexneri and Shigella sonnei are not related to different plasmid
    Inc-type carriage. Journal of global antimicrobial resistance. 2018;13:131-4.
مجله دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی مشهد
دوره 64، شماره 1
فروردین و اردیبهشت 1400
صفحه 2340-2352

فایل ها

هم رسانی

ارجاع به این مقاله

آمار